核因子-κB p65和骨橋蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織與細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性研究

白治苗，劉玉鋒，趙 樂，郭玉琳

(榆林市第二醫(yī)院婦科，陜西 榆林 719000)

子宮內(nèi)膜癌是圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性常見的三大生殖器惡性腫瘤之一[1-3]，主要臨床表現(xiàn)為異常陰道流血，治療主要為手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療。近年統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率逐年上升，甚至有超過宮頸癌的趨勢，對女性身體健康造成了極大危害，因此成為婦科疾病中的主要研究對象。目前該病分子相關(guān)發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為其發(fā)生是一個復(fù)雜、緩慢的過程。由于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞長期并持續(xù)地受雌激素刺激，并且缺乏孕激素的反向拮抗，引起子宮內(nèi)膜腺體增生、迂曲，失去正常形態(tài)，最終癌變而形成子宮內(nèi)膜癌[4-5]。在其發(fā)生與發(fā)展過程中，可能存在許多癌基因、抑癌基因、錯配修復(fù)基因及細(xì)胞炎癥因子等的參與[6-7]。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是由多種細(xì)胞共同分泌的、存在于細(xì)胞基質(zhì)中的一類糖蛋白，其分子結(jié)構(gòu)內(nèi)含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的特殊細(xì)胞結(jié)合序列[8-9]。有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，該特殊序列可通過與其受體整合素結(jié)合促進(jìn)核因子-κB (Nuclear factor kappa B，NF-κB)p65的釋放，進(jìn)而發(fā)揮后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)，該生物學(xué)效應(yīng)主要有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織中血管生長、促進(jìn)損傷后組織修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞存活等功能。另有研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，兩者引起的相關(guān)因子分泌是導(dǎo)致許多惡性腫瘤如甲狀腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌等的重要因素，因此兩者有可能是引起子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生的關(guān)鍵?；诖?，本研究探討NF-κB p65和OPN在子宮內(nèi)膜腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)并分析兩者的相關(guān)性，期望能為該病的靶向治療提供可靠的理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2016年9月至2021年1月于榆林市第二醫(yī)院婦科因子宮內(nèi)膜腺癌行全子宮切除術(shù)患者35例為子宮內(nèi)膜腺癌組，其中平均年齡(48.00±3.57)歲；平均體重指數(shù)(20.00±2.23 )kg/m2；FIGO分期中，Ⅰa期20例，Ⅰb期10例，Ⅱ期15例。收集同期因術(shù)前行診刮術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)為子宮內(nèi)膜非典型增生的患者35例為非典型增生內(nèi)膜組，其中平均年齡(46.00±4.21)歲；平均體重指數(shù)(19.50±2.32) kg/m2。收集同期因子宮肌瘤、子宮畸形、不孕癥接受手術(shù)治療后經(jīng)病理檢查診斷并排除子宮內(nèi)膜病變的正常子宮內(nèi)膜患者35例為正常子宮內(nèi)膜組，其中平均年齡(43.00±3.86)歲；平均體重指數(shù)(20.60±2.46) kg/m2。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三組患者年齡及體重指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者于術(shù)前3個月內(nèi)均未接受過激素類藥物治療，無生殖道炎癥及其他婦科疾病，無慢性肝炎、其他惡性腫瘤等慢性疾病史。所有患者及家屬已簽署知情同意書。本研究已經(jīng)通過醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 主要材料與試劑 子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞購自中國科學(xué)院(上海)生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所。鼠抗人NF-κB p65(批號：ZA15032，稀釋濃度1∶120)購自北京中杉金橋公司；OPN多克隆抗體(批號：716-456-142，稀釋濃度1∶100)購自美國Abcam生物公司；DAB顯色試劑盒(批號：180704)購自北京中杉生物工程公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑購自上海生工生物工程有限公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 NF-κB p65及OPN蛋白檢測(免疫組化法)：所有進(jìn)入研究的標(biāo)本均由本院病理科鏡下證實(shí)，經(jīng)過福爾馬林浸泡過夜，然后經(jīng)過10%甲醛進(jìn)行固定后脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚度連續(xù)切片，65 ℃烤箱烤片12 h后脫蠟，水洗后行抗原修復(fù)，一抗滴加過夜，PBS沖洗3次，二抗滴加2 h后滴加顯色劑顯色，酒精脫水后用二甲苯透明及中性樹膠封片，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。采用熒光顯微鏡觀察免疫染色結(jié)果，兩者均以胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或者棕黃色顆粒視為陽性表達(dá)。用Image Pro-Plus 5.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，計(jì)算每張切片平均光密度(IOD)值。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)：術(shù)中刮取正常內(nèi)膜組織20例于低溫箱中帶入細(xì)胞間，PBS沖洗后置于培養(yǎng)皿中，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入10 ml離心管中，加入5 ml 0.03% Ⅳ膠原酶，在37 ℃條件下反復(fù)消化3次，每次8 min。放于離心器中以500 r/min離心30 s。反復(fù)離心后顯微鏡下觀察，獲得子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，添加細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，分至80～100 mm培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日更換細(xì)胞培養(yǎng)液直至達(dá)到90%融合。

1.3.2.2 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞傳代：將從液氮中取出的細(xì)胞凍存管投入已經(jīng)預(yù)熱(37 ℃)的水浴鍋中迅速解凍并不斷搖動，1～2 min后取出，用75%酒精擦拭凍存管外壁，帶入超凈臺內(nèi)。將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液(1 ml)轉(zhuǎn)移到含9 ml培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)混勻，放入離心機(jī)中以1000 r/min 離心3～4 min。吸棄上清液，加入10 ml培養(yǎng)液，吹打混勻，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，次日換液后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 NF-κB p65及OPN mRNA相對表達(dá)量檢測(RT-PCR法)：待原代及傳代細(xì)胞融合至80%～90%，用胰酶消化，收集到離心管中，離心后去上清，PBS沖洗2～3次。將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的DEPC泡過的1.5 ml EP管中，加入TRIzol，然后用槍頭吹打混勻5～10 min，室溫放置3～5 min，每1 ml TRIzol液加入200 μl氯仿，手搖蕩15 s，室溫放置2～3 min。置4 ℃離心機(jī)中12000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新EP管，加500 μl異丙醇混勻，靜置5～10 min。置4 ℃離心機(jī)中12000 r/min 離心10 min，可見管底白色沉淀，棄上清，置4 ℃離心機(jī)中7500 r/min離心5～10 min。棄上清，室溫干燥5～10 min，迅速用20～30 μl DEPC水溶解RNA，混勻后測濃度。cDNA合成：按照試劑盒說明行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(以β-actin為內(nèi)參)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量根據(jù)2-△△CT計(jì)算。

1.3.4 NF-κB p65及OPN蛋白檢測(Western blot法)：從原代及傳代細(xì)胞中提取蛋白，制備SDS-PAGE膠后電泳分離蛋白樣本，進(jìn)過轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗孵育(根據(jù)說明書，OPN按1∶100稀釋)后，于BIO-RAD成像儀中曝光成像并測定各蛋白條帶光密度值并計(jì)算相應(yīng)的光密度比值。

2 結(jié) 果

2.1 三組患者NF-κB p65蛋白免疫組化染色結(jié)果比較 見圖1。NF-κB p65蛋白大部分表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，少量表達(dá)于胞核中，極少量表達(dá)于子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中。子宮內(nèi)膜腺癌組IOD值為1.568±0.236，非典型增生內(nèi)膜組IOD值為0.628±0.196，正常子宮內(nèi)膜組IOD值為0.389±0.157，三組患者IOD比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.805，P=0.000)。另外，子宮內(nèi)膜腺癌組和非典型增生內(nèi)膜組IOD值高于正常子宮內(nèi)膜組(t=-5.655、-3.587，均P<0.001)，且子宮內(nèi)膜腺癌組高于非典型增生內(nèi)膜組(t=-4.988，P<0.001)。

2.2 三組患者OPN蛋白免疫組化染色結(jié)果比較 見圖2。OPN蛋白大部分表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，只有少數(shù)表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞中。子宮內(nèi)膜腺癌組IOD值為1.568±0.136，非典型增生內(nèi)膜組IOD值為0.875±0.158，正常子宮內(nèi)膜組IOD值為0.458±0.125，三組患者IOD比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.805，P=0.000)。另外，子宮內(nèi)膜腺癌組和非典型增生內(nèi)膜組IOD值高于正常子宮內(nèi)膜組(t=-6.355、-3.687，均P<0.001)，且子宮內(nèi)膜腺癌組高于非典型增生內(nèi)膜組(t=-4.687，P<0.001)。

A：正常子宮內(nèi)膜組；B：非典型增生內(nèi)膜組；C：子宮內(nèi)膜腺癌組

2.3 兩組細(xì)胞中NF-κB p65和OPN蛋白與mRNA相對表達(dá)水平比較 見表1。Western blot結(jié)果顯示，NF-κB p65和OPN蛋白在子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞中的相對表達(dá)水平明顯高于正常內(nèi)膜細(xì)胞(均P<0.05)。RT-PCR結(jié)果亦顯示，NF-κB p65和OPN mRNA在子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞中的相對表達(dá)水平明顯高于正常內(nèi)膜細(xì)胞(均P<0.05)。

表1 兩組細(xì)胞中NF-κB p65和OPN蛋白與mRNA相對表達(dá)水平比較

2.4 三組患者NF-κB p65和OPN蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，子宮內(nèi)膜腺癌組和非典型增生內(nèi)膜組中，NF-κB p65和OPN蛋白表達(dá)具有相關(guān)性(r=0.78、0.88，均P<0.001)，但在正常子宮內(nèi)膜組中兩者蛋白表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生呈逐年上升趨勢，其治療以手術(shù)為主，術(shù)后放化療為輔。但因部分患者術(shù)后失訪，或無法耐受放化療，故術(shù)后復(fù)發(fā)概率仍高，是婦科醫(yī)生重點(diǎn)關(guān)注的難題之一[15-16]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65在許多惡性腫瘤組織的主要細(xì)胞中表達(dá)明顯增強(qiáng)，如惡性程度較高的宮頸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等[17-19]。研究發(fā)現(xiàn)其主要促進(jìn)細(xì)胞過度增殖，抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)惡性組織中的血管生成及轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。但NF-κB通路在子宮內(nèi)膜腺癌中的研究甚少，尤其兩者因子于細(xì)胞分子水平的研究更少。Guo等[20]首次發(fā)現(xiàn)OPN與其受體結(jié)合后可促進(jìn)NF-κB p65的釋放，進(jìn)而引起一系列細(xì)胞因子釋放，最終導(dǎo)致各種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

本研究通過免疫組化方法在組織水平上檢測正常子宮內(nèi)膜組織、非典型增生子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜腺癌組織上皮中NF-κB p65與OPN蛋白的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)兩者于子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)明顯高于非典型增生的內(nèi)膜組織，也高于正常子宮內(nèi)膜組織，差異均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與既往研究結(jié)果[21]相符。本研究于細(xì)胞水平通過子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)檢測兩者蛋白及mRNA的相對表達(dá)水平，通過子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞傳代培養(yǎng)后檢測兩者蛋白及mRNA的表達(dá)，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均提示兩者于子宮內(nèi)膜癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)增高明顯，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

國內(nèi)學(xué)者于細(xì)胞水平抑制NF-κB 后發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力明顯減弱，且細(xì)胞周期明顯縮短，進(jìn)一步說明NF-κB 的高表達(dá)可能是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜腺癌的關(guān)鍵因子。國外研究[22]發(fā)現(xiàn)OPN與子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞的侵襲性、黏附性明顯相關(guān)。因子宮內(nèi)膜異位癥與子宮內(nèi)膜癌有著相似的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)性能，因此OPN與子宮內(nèi)膜癌腺上皮細(xì)胞的侵襲性、黏附性是否有著相似的相關(guān)性值得深究。如果存在相關(guān)性，那么OPN是通過與哪一個受體結(jié)合，結(jié)合后如何促進(jìn)NF-κB p65的釋放及引起哪些因子的分泌，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，有待于后期的實(shí)驗(yàn)。例如，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞行質(zhì)粒導(dǎo)入增強(qiáng)其表達(dá)，或行特異性siRNA干擾沉默其表達(dá)后檢測兩者蛋白以及mRNA的表達(dá)水平、細(xì)胞遷移能力、侵襲性變化等，于子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入熒光標(biāo)記，再次行特異增強(qiáng)及減弱兩者的表達(dá)以進(jìn)一步證實(shí)推測。

綜上所述，NF-κB p65和OPN在子宮內(nèi)膜癌組織及細(xì)胞中表達(dá)較高，有可能是形成該病的分子通路，為該病的靶向治療提供了理論依據(jù)及重要靶點(diǎn)。但本研究也存在不足之處，如實(shí)驗(yàn)樣本量過小，后期研究中將盡可能地加大樣本量，以增加研究數(shù)據(jù)及結(jié)論的可靠性。