糞便硫酸類肝素蛋白多糖2與分泌型卷曲相關(guān)蛋白2基因甲基化檢測(cè)在結(jié)直腸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值

張利偉，胡海燕

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)屬于臨床上較為常見的消化系統(tǒng)疾病之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)所有惡性腫瘤中位居第三，且每年約有130多萬(wàn)新增病例，更有69萬(wàn)人因CRC死亡[1-3]。隨著近年來(lái)人們生活方式的日益變化及人口老齡化問(wèn)題的逐漸嚴(yán)重，CRC發(fā)病人數(shù)逐漸增加，且發(fā)病年齡逐漸減小，已受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[4]。由于該病發(fā)病早期具有極強(qiáng)的隱匿性，一經(jīng)確診便已是中晚期，喪失了手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)，因此預(yù)后較差[5]。早期準(zhǔn)確診斷CRC對(duì)臨床治療及預(yù)后具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。既往臨床上主要通過(guò)腸鏡、糞便隱血試驗(yàn)以及血清腫瘤標(biāo)志物等進(jìn)行CRC的診斷，但均有一定的臨床局限性[6]。有研究[7-8]表明，糞便中分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(Secreted frizzled related protein 2，SFRP2)基因甲基化是一種潛在的CRC篩查的非侵入性生物標(biāo)志物，糞便硫酸類肝素蛋白多糖2(Syndecan-2，SDC2)基因甲基化檢測(cè)也可作為大腸癌早期篩查的無(wú)創(chuàng)診斷方法。鑒于此，本研究分析糞便SDC2聯(lián)合SFRP2基因甲基化檢測(cè)在CRC篩查中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床診斷提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年1月至2021年9月在齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科或消化內(nèi)科接受診治的CRC患者51例為CRC組，其中男性27例，女性24例；年齡34～78歲，平均(55.23±10.38)歲；近端17例，遠(yuǎn)端34例；腫瘤直徑11～48 mm，平均(31.23±5.32)mm；TNM分期中，Ⅰ-Ⅱ期21例，Ⅲ-Ⅳ期30例；低分化15例，中高分化36例。選取同期進(jìn)展期腺瘤患者61例為進(jìn)展期腺瘤組，其中男性34例，女性27例；年齡32～79歲，平均(55.34±10.45)歲。選取同期健康體檢者50例為正常對(duì)照組，其中男性26例，女性24例；年齡31～78歲，平均(55.21±10.38)歲。三組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)[9]：所有CRC及進(jìn)展期腺瘤患者均經(jīng)病理檢查確診；入組前尚未接受相關(guān)治療；均為成年人。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；伴有重要臟器嚴(yán)重病變者；)意識(shí)障礙或合并精神疾病者；研究期間因故退出或失訪者。入組研究對(duì)象均于同意書上簽名。醫(yī)院倫理委員會(huì)已批準(zhǔn)本研究。

1.2 研究方法 首先采集所有受試者的新鮮糞便2～5 g，分別置于兩管之中，一管為干燥采樣管，另一管為裝有15 ml糞便保存液的采樣管，充分混勻。保存于常溫條件下，3 d內(nèi)完成相關(guān)處理。遵循QIAamp DNA Stool Mini Kit(批號(hào)：51504，德國(guó)QIAGEN公司)說(shuō)明書完成標(biāo)本DNA提取。隨后，根據(jù)說(shuō)明書完成糞便DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化操作。最后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法完成SDC2、SFRP2基因甲基化的檢測(cè)。反應(yīng)體系35 μl，組成如下：17.5 μl PCR反應(yīng)預(yù)混試劑，2.5 μl反應(yīng)液，15 μl重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后DNA。反應(yīng)液的構(gòu)成包括探針、引物以及ddH2O。且SDC2、SFRP2及內(nèi)參基因(GAPDH)分別有相應(yīng)反應(yīng)液。CpGenome Universal Methylated DNA(批號(hào)：S7821，德國(guó)默克公司)和Unmethylated DNA(批號(hào)：S7822，德國(guó)默克公司)也經(jīng)亞硫酸化處理，以此作為陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。由Beacon Designer 8完成正、反向引物的設(shè)計(jì)與合成。

1.3 觀察指標(biāo) 比較三組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化情況；分析糞便SDC2及SFRP2基因甲基化與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系；分析糞便SDC2及SFRP2甲基化篩查CRC的效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理工具選擇SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，行χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析糞便SDC2及SFRP2基因甲基化檢測(cè)篩查CRC的效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化情況比較 見表1。CRC組患者糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率高于進(jìn)展期腺瘤組和正常對(duì)照組，且進(jìn)展期腺瘤組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率高于正常對(duì)照組(均P<0.05)。

表1 三組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化情況比較[例(%)]

2.2 糞便SDC2基因甲基化與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。TNM分期Ⅲ-Ⅳ期CRC患者糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率高于Ⅰ-Ⅱ期患者(均P<0.05)。而性別、年齡、病變部位、腫瘤大小以及分化程度均與CRC患者糞便SDC2及SFRP2基因甲基化無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。

表2 糞便SDC2基因甲基化與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 糞便SDC2及SFRP2基因甲基化檢測(cè)篩查CRC的效能 見表3。ROC曲線分析顯示，糞便SDC2及SFRP2基因甲基化單項(xiàng)檢測(cè)篩查CRC的效能較高，且兩者聯(lián)合檢測(cè)的效能高于單項(xiàng)檢測(cè)。

表3 糞便SDC2及SFRP2基因甲基化檢測(cè)篩查CRC的效能

3 討 論

迄今為止，關(guān)于CRC的具體病因及發(fā)病機(jī)制尚存在一定爭(zhēng)議，目前普遍認(rèn)為可能和遺傳、生活方式以及精神壓力等因素有關(guān)[10-12]。因其發(fā)病早期無(wú)特異性癥狀，絕大多數(shù)患者一經(jīng)確診便已是中晚期，臨床治療效果較差，預(yù)后不良[13-14]。由此可見，加強(qiáng)對(duì)人群CRC的篩查，提高早期腫瘤的檢出率，顯得尤為重要，亦是降低CRC發(fā)病率及改善預(yù)后的重中之重。結(jié)腸鏡檢查是得到廣泛認(rèn)可的篩查CRC金標(biāo)準(zhǔn)，但其屬于有創(chuàng)檢查，且在檢查前需要較為復(fù)雜的腸道準(zhǔn)備，加之檢查過(guò)程中會(huì)對(duì)患者造成不同程度的痛苦，具有一定的出血或(和)穿孔風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致患者檢查依從性較低[15-16]。而糞便DNA檢測(cè)是近年來(lái)所發(fā)展起來(lái)的一種早期篩查手段，其主要通過(guò)采集糞便中脫落細(xì)胞DNA，繼而明確CRC過(guò)程中的基因變化，具有無(wú)創(chuàng)性、無(wú)需腸道準(zhǔn)備等優(yōu)勢(shì)[17-18]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC組患者糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率均高于良性進(jìn)展期腺瘤組和正常對(duì)照組，且進(jìn)展期腺瘤組糞便SDC2及SFRP2基因甲基化率均高于正常對(duì)照組，這提示了CRC及進(jìn)展期腺瘤中存在異常的SDC2和SFRP2基因甲基化。究其原因，SDC2基因參與了細(xì)胞分裂、遷移等過(guò)程，且有研究[19]證實(shí)腫瘤組織內(nèi)的SDC2目標(biāo)區(qū)域甲基化水平明顯高于成對(duì)相鄰非腫瘤組織中的SDC2目標(biāo)區(qū)域，因此該基因甲基化異?？沙蔀镃RC早期檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物之一。SFRP2基因定位于染色體4q31.3上，含有2個(gè)內(nèi)含子及3個(gè)外顯子，且第1外顯子周圍分布高密度CpG島，和腫瘤細(xì)胞DNA甲基化息息相關(guān)，是Wnt信號(hào)通路的信號(hào)拮抗因子，而Wnt信號(hào)通路又在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。另外，本研究結(jié)果還顯示了TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期CRC患者糞便SDC2、SFRP2基因甲基化率高于Ⅰ-Ⅱ期患者，這反映了糞便SDC2、SFRP2基因甲基化和CRC患者臨床分期密切相關(guān)，即隨著上述基因甲基化的發(fā)生，CRC患者病情加劇，兩者具有作為評(píng)估CRC患者病情嚴(yán)重程度的潛在價(jià)值。分析其原因，可能是上述兩項(xiàng)基因甲基化頻繁發(fā)生于CRC中，在腫瘤的分化、繁殖過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。然而，多項(xiàng)研究[20-22]發(fā)現(xiàn)，糞便基因SDC2基因甲基化和CRC患者TNM分期無(wú)關(guān)，本研究結(jié)果與其不一致，其原因可能與研究樣本量、基因組DNA來(lái)源不同有關(guān)。此外，經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，糞便SDC2及SFRP2基因甲基化單項(xiàng)檢測(cè)篩查CRC的效能較高，且兩者聯(lián)合檢測(cè)的效能高于單項(xiàng)檢測(cè)，與柏愚等[23]研究結(jié)果一致。究其原因，雙基因聯(lián)合檢測(cè)可覆蓋多種腫瘤形成的分子途徑，進(jìn)一步為臨床診斷提供更為全面、可靠的數(shù)據(jù)，繼而達(dá)到提高檢測(cè)靈敏度及特異度的目的。

綜上所述，糞便SDC2及SFRP2基因甲基化檢測(cè)有助于篩查CRC，具有較高的臨床推廣應(yīng)用價(jià)值。