先天性心臟病患兒血清微小RNA-148b-3p表達(dá)水平及臨床意義

潘 婉，李 偉，徐永君，孫 婧，張勇剛，鄭永強(qiáng)

(1.宜昌市第二人民醫(yī)院 三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院兒科，湖北 宜昌 443000；2.宜昌市第二人民醫(yī)院 三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443000；3.漢川市人民醫(yī)院兒科，湖北 漢川 431699；4.宜昌市第二人民醫(yī)院 三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 宜昌 443000)

先天性心臟病多發(fā)于不滿1周歲的兒童群體，是新生兒疾病中常見(jiàn)的一種新血管疾病，是由于胎兒期心血管發(fā)育異常所造成的畸形病變。這種病有病程較長(zhǎng)、致死率較高、預(yù)后較差等特征。據(jù)調(diào)查，全球每出生100名新生兒，就有8名患有先天性心臟病。先天性心臟病患兒由于異常的血流動(dòng)力學(xué)，所以存在生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、免疫力低下、容易感染等問(wèn)題[1-2]。先天性心臟病是多種病因綜合作用的結(jié)果，該疾病譜系較廣，具有單純房間隔缺損、單純室間隔缺損、心內(nèi)膜墊缺損、法洛四聯(lián)癥等多種分型，一些患兒會(huì)同時(shí)合并多種畸形，病情較輕者可以終生無(wú)癥狀出現(xiàn)，但嚴(yán)重者可致死亡[3-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是由25個(gè)核苷酸組成的一類短鏈RNA。miR-148b-3p作為miRNA的一種，已經(jīng)被報(bào)道與多種癌癥的發(fā)生具有密切關(guān)系，如胃癌、乳腺癌、肺腺癌、腎癌等[5-7]。miR-148b-3p在之前的研究中也被作為缺血性腦卒中的生物學(xué)標(biāo)志物[8-9]，但是miR-148b-3p在先天性心臟病患兒中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究探究先天性心臟病患兒血清miR-148b-3p的表達(dá)水平以及其與心功能指標(biāo)之間的關(guān)系，分析其臨床意義，希望為先天性心臟病的治療及診斷提供一定的參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019年1月至2020年10月本院門診及心內(nèi)科病房收治的先天性心臟病患兒150例為研究對(duì)象(試驗(yàn)組)，其中男性80例，女性70例；年齡4個(gè)月至3歲。根據(jù)患兒情況又分為單純房間隔缺損組(48例)、單純室間隔缺損組(37例)以及復(fù)合組(65例)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒經(jīng)臨床診斷、心電圖檢查等確診為先天性心臟病；具有完整臨床資料；患兒全程的疾病治療均在本院進(jìn)行。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝、腎功能損傷；患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病；患有嚴(yán)重的肝臟疾病、消化系統(tǒng)疾病；患有電解質(zhì)紊亂。選取同期在本院進(jìn)行健康體檢的兒童150例為對(duì)照組，其中男性74例，女性76例；年齡4個(gè)月至3歲。本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲得患兒家屬同意并簽字，同時(shí)符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(批號(hào)：DP315；北京天根生化有限公司)；人肌鈣蛋白I(cTnI)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號(hào)：20180602；鄭州博賽生物技術(shù)研究所)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：20180821；南京Vazyme生物公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(批號(hào)：20181108；德國(guó)QIAGEN公司)；引物(批號(hào)：20180724；上海生工生物工程公司)。超聲心電圖儀購(gòu)自美國(guó)惠普公司；MODEL550型酶標(biāo)儀、qRT-PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集與保存：分別采集兩組兒童空腹靜脈血血清樣本(8 ml/人)，離心后小心收集血清樣本，將其置于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.3.2 血清miR-148b-3p表達(dá)水平檢測(cè)：采用qRT-PCR檢測(cè)兩組兒童血清miR-148b-3p表達(dá)水平。采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用qRT-PCR儀對(duì)miR-148b-3p進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法對(duì)miR-148b-3p表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。miR-148b-3p、U6(內(nèi)參)引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.3.3 血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、cTnI水平檢測(cè)：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)兩組兒童血清中CK-MB水平。采用ELISA法檢測(cè)兩組兒童血清中cTnI水平，操作步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.4 心功能指標(biāo)檢測(cè)：對(duì)兩組兒童進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，評(píng)估心肌收縮能力，記錄左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室舒張末期容積指數(shù)(LVEDVI)以及左心室收縮末期室壁應(yīng)力(LVESWS)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組兒童一般資料比較 見(jiàn)表2。兩組兒童體重指數(shù)、年齡、性別、身高比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 兩組兒童一般資料比較

2.2 兩組兒童血清miR-148b-3p及心功能指標(biāo)水平比較 見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組患兒miR-148b-3p、cTnI、CK-MB、LVEDVI、LVESWS水平顯著升高，LVEF顯著降低(均P<0.05)。

表3 兩組兒童血清miR-148b-3p及心功能指標(biāo)水平比較

2.3 三組患兒血清miR-148b-3p表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4。單純房間隔缺損組、單純室間隔缺損組、復(fù)合組患兒血清miR-148b-3p水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單純房間隔缺損組和單純室間隔缺損組患兒血清miR-148b-3p水平顯著高于復(fù)合組(均P<0.05)，但單純房間隔缺損組患兒血清miR-148b-3p水平與單純室間隔缺損組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 三組患兒血清miR-148b-3p表達(dá)水平比較

2.4 先天性心臟病患兒血清miR-148b-3p水平與心功能指標(biāo)相關(guān)性分析 見(jiàn)表5。Pearson相關(guān)性分析顯示，先天性心臟病患兒血清miR-148b-3p水平與cTnI、CK-MB及LVEDVI、LVESWS呈正相關(guān)(P<0.05)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。

表5 先天性心臟病患兒血清miR-148b-3p水平與心功能指標(biāo)的相關(guān)性

2.5 血清miR-148b-3p水平對(duì)先天性心臟病患兒的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析顯示，miR-148b-3p水平預(yù)測(cè)先天性心臟病患兒的曲線下面積為0.873，截?cái)嘀禐?.28，敏感度為81.33%，特異度為85.67%。

3 討 論

先天性心臟病與環(huán)境、遺傳等因素密切相關(guān)，屬于非傳染性疾病，是在人出生時(shí)便存在的心臟、血管功能以及結(jié)構(gòu)發(fā)生異常的心臟類疾病，在兒科中較為常見(jiàn)，大約有60%的患兒不到1歲便死亡，是導(dǎo)致新生兒死亡的主要疾病之一[10-12]。先天性心臟病的發(fā)病原因主要是胚胎早期發(fā)育停滯現(xiàn)象或者胚胎發(fā)育異常，在臨床表現(xiàn)上較為復(fù)雜化和多樣化，較多為發(fā)育不良、感冒、反復(fù)呼吸道感染等癥狀[13]。近些年來(lái)，先天性心臟病患兒的發(fā)病率在全球呈現(xiàn)著逐年升高趨勢(shì)，給患兒的整個(gè)家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響著患兒的正常生長(zhǎng)。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，某些生物標(biāo)志物能夠很準(zhǔn)確地反映疾病的發(fā)展?fàn)顩r，并可用于疾病的早期診斷及預(yù)后評(píng)估。沈海霞[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，miR-133a在先天性心臟病患兒血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，與先天性心臟病的進(jìn)程存在密切相關(guān)。

miRNA屬于內(nèi)源性非編碼小RNA分子，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，在機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞分化以及疾病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用，可以通過(guò)靶向調(diào)控下游基因的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等生物學(xué)行為。近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞，并涉及多種疾病以及相關(guān)生物學(xué)行為。有研究[15-17]發(fā)現(xiàn)，miR-148b-3p與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤增殖生長(zhǎng)。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，miR-148b-3p在膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力方面具有非常重要的調(diào)控作用。王嘉明等[19]研究證明，miR-148b-3p可以影響心肌細(xì)胞的增殖和凋亡，將來(lái)可能成為治療及診斷心血管疾病的靶點(diǎn)。龔化等[20]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，miR-148b-3p在前列腺癌患者中表達(dá)水平降低，并且參與調(diào)控前列腺疾病中癌細(xì)胞的增殖與遷移過(guò)程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組患兒cTnI、CK-MB、LVEDVI、LVESWS、miR-148b-3p水平顯著升高，LVEF顯著降低，提示先天性心臟病患兒存在心功能異常，且miR-148b-3p可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因表達(dá)影響心肌細(xì)胞的增殖和凋亡等生物學(xué)行為，進(jìn)而參與先天性心臟病發(fā)生。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，先天性心臟病患兒血清miR-148b-3p水平與cTnI、CK-MB及LVEDVI、LVESWS呈正相關(guān)，與LVEF呈負(fù)相關(guān)，表明miR-148b-3p可能通過(guò)某些機(jī)制直接或間接影響著心功能指標(biāo)的變化，從而對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響。進(jìn)一步將先天性心臟病患兒分為單純房間隔缺損組、單純室間隔缺損組、復(fù)合組三組，發(fā)現(xiàn)單純房間隔缺損組、單純室間隔缺損組患兒血清miR-148b-3p水平顯著高于復(fù)合組，說(shuō)明miR-148b-3p水平與先天性心臟病的患病程度具有相關(guān)性，可能影響疾病發(fā)展進(jìn)程，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。此外，ROC曲線分析顯示，miR-148b-3p水平預(yù)測(cè)先天性心臟病患兒的曲線下面積、敏感度、特異度分均較高，說(shuō)明miR-148b-3p可以用來(lái)預(yù)測(cè)先天性心臟病患兒。

綜上所述，先天性心臟病患兒血清miR-148b-3p表達(dá)水平較高，且與先天性心臟病患兒心功能指標(biāo)具有相關(guān)性，可以作為預(yù)測(cè)先天性心臟病患兒及評(píng)估其病情的參考指標(biāo)。