腰椎間盤退變患者髓核組織中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1、白細胞介素-1β表達及相關性研究

馮 昊，王巖松，劉丹平

(錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121001)

腰椎間盤退變(Lumbar disk degeneration，LDD)是常見的肌肉骨骼退行性疾病之一，可導致骨不穩定，神經元件受壓，椎管尺寸減小，可能導致下腰痛和單側或雙側小腿疼痛[1-2]。LDD患者中70%～85%終身出現腰痛，生活質量受到嚴重影響[3]。流行病學研究[4]指出，大約40%的30歲以下和90%的55歲以上的人存在LDD。隨著社會的老齡化發展，LDD發病率不斷上升，LDD逐步成為主要的社會健康問題。目前LDD的具體原因和發病機制研究已有很大進展，但尚未完全闡明。研究[5]指出，LDD是一個復雜的多因素過程，其機制包括組織纖維化、炎癥反應、椎間盤營養不良、細胞外基質變化、自然衰老和累積損傷等。目前已知，LDD患者椎間盤組織中的炎癥分子水平升高，并已被證明與退變程度有關。椎間盤組織由髓核、纖維環和終板軟骨構成，其中髓核組織退變在LDD病理過程中扮演重要角色[6]。成年人椎間盤髓核主要由胞外基質及軟骨樣髓核細胞構成[7]。在髓核組織中，髓核細胞參與調控細胞外機制的合成/降解平衡。研究[8]顯示炎癥因子過度表達能夠促進髓核細胞凋亡，從而抑制細胞外基質合成，最終促進LDD疾病進程。白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)是炎癥反應中的關鍵細胞因子，在LDD病理過程中扮演重要角色[9-10]。有研究[11]指出，退化椎間盤組織中IL-1β表達水平與正常椎間盤組織相比明顯升高，其表達與椎間盤退變程度呈正相關。此外，IL-1β能夠通過促進具有降解細胞外基質的酶表達上升而導致椎間盤退化；IL-1β還參與LDD過程中疼痛的發展。Kawaguchi等[12]研究指出，IL-1β T等位基因攜帶者患有LDD的風險顯著上升。IL-1β首先作為非活性前體合成IL-1β前體(pro-IL-1β)，需要由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)裂解其氨基末端區域以改變成活性形式。雖然已知IL-1β參與了LDD的發病機制，但Caspase-1在這一過程中的作用仍然未知。因此，本研究探討在LDD患者髓核組織Caspase-1、IL-1β表達水平變化，并分析其與LDD疾病嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2020年12月在我院就診的LDD患者45例為觀察組，均經MRI診斷為LDD，并因腰痛接受了脊柱融合手術或椎間盤置換手術。另選取同期因脊柱創傷導致非退行性椎間盤病變并需要手術干預的患者43例為對照組。排除標準：患有坐骨神經痛、退行性椎管狹窄、腫瘤、感染，既往有腰部手術史。觀察組男性26例，女性19例；年齡39～64歲，中位年齡42歲；體重指數(22.14±4.18)kg/m2。對照組男性27例，女性15例；年齡29～63歲，中位年齡41歲；體重指數(23.26±4.12)kg/m2。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。根據Pfirrmann分級系統[13]，觀察組又分為輕度病變組(10例)、中度病變組(16例)和重度病變組(14例)。所有患者已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測Caspase-1、IL-1β mRNA表達：使用TRIzol試劑(批號：15596026，賽默飛世爾科技公司)提取LDD患者髓核組織中總RNA。使用分光光度計在260/280 nm處對mRNA進行定量。根據制造商協議，使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(批號：RR047QT，Takara Bio Inc公司)將1 μg RNA反轉錄成cDNA。在含有2 μl cDNA(500 ng/μl)、0.8 μl正向引物(10 μmol/L)、0.8 μl反向引物(10 μmol/L)、10 μl 2× SYBR Premix Ex Taq Ⅱ的反應混合物中進行qPCR反應。熱循環條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。Caspase-1、IL-1β mRNA表達水平用2-ΔΔCT方法進行量化。以GAPDH為內參。各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.2.2 Western blot檢測Caspase-1、IL-1β蛋白表達：制備蛋白樣品后置于-70 ℃保存備用。變性后用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBST)洗滌3次，一抗(Caspass-1一抗批號：E-AB-18207，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司； IL-1β一抗批號：AP8531C，美國ABGENT公司)孵育4 ℃過夜。TBST洗滌3次后，二抗室溫孵育1 h。TBST 洗滌4次后，使用超敏ECL化學發光試劑盒處理PVDF膜，之后將PVDF膜快速放入X線片暗盒曝光。曝光好的X線片放于顯影液，黑暗環境顯影，定影。底片掃描，用Image J軟件對條帶進行定量分析，以目的條帶和GAPDH條帶積分吸光度比值作為最終結果。

1.2.3 免疫組化法檢測Caspase-1、IL-1β蛋白表達：髓核組織切片在含有5%山羊血清和0.25% Triton X-100的PBS中進行阻斷。通過在0.6%的過氧化氫中孵化來減弱內源性過氧化物。使用相同的緩沖液，然后將切片在室溫下與一抗孵育過夜。在室溫下用相應生物素化的山羊二抗(1∶500)孵化2 h。使用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒進行染色。上述每個步驟之后，在TBS-0.25% Triton X-100中漂洗4次，每次5 min。使用顯微成像系統鏡檢，拍照觀察并進行分析。

1.2.4 HE染色和病理學評分(HDS)：應用4%多聚甲醛將椎間盤組織進行固定，隨后應用冰凍切片法進行切片，制備厚度為5 μm的冰凍切片。應用常規HE染色方法進行染色，使用顯微成像系統鏡檢，拍照觀察并進行分析。應用HDS[14]方法對椎間盤組織的病理損傷程度進行組織學評分。

1.3 觀察指標 比較各組患者髓核組織HE染色結果；比較各組患者髓核組織Caspase-1、IL-1β mRNA及蛋白表達水平；分析Caspase-1、IL-1β mRNA表達水平與Pfirrmann分級、HDS組織學評分的相關性，以及Caspase-1與IL-1β mRNA表達水平間的相關性；分析LDD患者疾病嚴重程度的影響因素。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件進行分析。組間計量資料比較采用方差分析或LSD-t檢驗。相關性分析采用Spearman法。LDD患者疾病嚴重程度的影響因素采用Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組患者髓核組織HE染色結果 見圖1。對照組髓核組織整體結構較疏松，基質成分基本完整，細胞外基質中可見較多髓核細胞分布，呈圓形或扁卵圓形，胞核較大，有“核團聚”現象。觀察組髓核組織密集皺縮，基質成分不完整，可見少量髓核細胞分布于細胞外基質，呈不規則形狀，輪廓模糊，結構不完整，有新生血管長入，髓核細胞密度較對照組明顯降低，髓核細胞減少與病變程度呈正比。

A：對照組；B：輕度病變組；C：中度病變組；D：重度病變組

2.2 各組患者髓核組織Caspase-1、IL-1β mRNA及蛋白表達水平比較 見圖2、3。與對照組相比，觀察組Caspase-1、IL-1β mRNA及蛋白表達水平均顯著上升(均P<0.05)；在觀察組中，隨著疾病程度逐漸加重，Caspase-1、IL-1β mRNA及蛋白表達水平均逐漸上升(均P<0.05)。免疫組化結果顯示，Caspase-1、IL-1β蛋白主要分布于細胞質中，表達水平及趨勢同Western blot結果。

注：與對照組比較，*P<0.05；與輕度病變組比較，#P<0.05；與中度病變組比較，△P<0.05

圖3 各組患者髓核組織Caspase-1、IL-1β蛋白免疫組化染色結果(×100)

2.3 髓核組織中Caspase-1、IL-1β mRNA表達含量與Pfirrmann分級相關性分析 見圖4。Spearman相關性分析表明，Caspase-1、IL-1β mRNA表達水平與Pfirrmann分級呈正相關關系(r=0.5386、0.6656，均P<0.05)，與HDS評分呈正相關關系(r=0.5585、0.4899，均P<0.05)；此外，Caspase-1與IL-1β mRNA表達水平間亦呈正相關關系(r=0.4441，P<0.05)。

圖4 LDD患者髓核組織Caspase-1、IL-1β mRNA表達水平與Pfirrmann分級、HDS評分相關性分析

2.4 LDD患者疾病嚴重程度影響因素分析 見表2。Logistic回歸分析顯示，髓核組織中Caspase-1、IL-1β mRNA表達水平與LDD患者疾病嚴重程度具有相關性，是LDD患者疾病嚴重程度的影響因素。

表2 LDD患者疾病嚴重程度影響因素分析

3 討 論

本研究結果顯示，在LDD患者髓核組織中，Caspase-1、IL-1β mRNA及蛋白表達水平顯著上升，且LDD患者髓核組織Caspase-1、IL-1β表達水平的上升與LDD患者疾病嚴重程度顯著相關。這一發現為髓核組織中Caspase-1/IL-1β途徑的激活在LDD疾病進展中扮演的促疾病發展角色提供了證據。

椎間盤組織力學特征的變化由椎間盤髓核組織的彈性與張力決定。成年人椎間盤髓核內主要由胞外基質以及軟骨樣髓核細胞構成。髓核組織力學特征的退變與髓核組織的細胞外基質降解的增多存在因果關系[15]。在LDD中，髓核組織中出現普遍的細胞外基質降解，而基質金屬蛋白酶(MMP)家族表達水平和活性的顯著增多在細胞外基質降解中扮演著重要角色[16]。與本研究結果一致，目前研究認為IL-1β在LDD患者的疾病進程中扮演著重要的角色，IL-1β與MMP家族表達水平和活性以及基質基因的表達具有顯著的相關性。例如，Xu等[17]研究指出，在腰椎小關節退變中，IL-1β能夠顯著促進MMP-1的過表達；Le-Maitre等[18]研究指出，應用IL-1β處理人類椎間盤細胞能夠導致基質降解酶MMP-3、MMP-13、含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-4(ADAMTS-4)基因表達水平顯著增加，而基質基因聚蛋白多糖、膠原蛋白Ⅱ、膠原蛋白Ⅰ和SOX6的表達減少。此外，研究[19]指出，在人關節軟骨細胞中，IL-1β還能誘導MMP-7的表達。本研究表明，在LDD患者髓核組織中，IL-1β表達水平較對照組顯著上升，事實上由于對照組患者并不是健康人群，他們是經歷過嚴重創傷的患者，這可能影響了我們觀察到的IL-1β表達水平，在真實狀態下IL-1β的表達水平差異可能會更大。

促炎癥刺激誘導非活性IL-1β原形的表達，但其活性、成熟和分泌受炎癥體和Caspase-1的控制。Caspase-1介導了炎癥的信號通路，促進促炎癥因子IL-1β的活性形式表達增多。此外，還有研究[20]表明，在多種細胞系中，Caspase-1能夠促進IL-1β的表達，而敲低Caspase-1的表達能夠在mRNA水平抑制IL-1β的表達。Caspase-1不僅能在蛋白水平調控IL-1β的活性，還能夠在mRNA水平調控IL-1β的表達。本研究中，Spearman相關性分析發現，Caspase-1、IL-1β mRNA表達水平與Pfirrmann分級、HDS評分呈正相關關系，Caspase-1與IL-1β mRNA表達水平間亦呈正相關關系。研究[21]表明，Caspase-1是一個與骨關節炎有密切聯系的危險因素，并加速了關節軟骨的破壞。此外，Tang等[22]研究指出，NOD樣受體家族3(NLRP3)/Caspase-1/IL-1β軸能夠顯著促進腰椎軟骨終板的退變，而后者可導致營養供應減少、氧張力降低和乳酸累積，從而加速退變過程。然而，促進軟骨終板退變的IL-1β源自何處目前尚不知曉。本研究中，在LDD患者的早期髓核組織中IL-1β表達水平即發生顯著增加，因此促進軟骨終板退變的IL-1β可能源自髓核組織，這一點仍待進一步的驗證。

綜上所述，LDD患者髓核組織Caspase-1、IL-1β表達水平上升，且與疾病嚴重程度相關。因此，Caspase-1/IL-1β軸參與了LDD的發病機制，可能成為LDD的治療靶點。