骨髓間充質干細胞通過增加血管生成和血管內皮生長因子表達影響大鼠隨意型皮瓣存活實驗研究

馮 亮，樊 力

(陜西省核工業二一五醫院手足外科，陜西 咸陽 712000)

皮瓣是一類復合組織塊，包括由皮膚、皮下組織、深層次組織、血供組織等[1]。皮瓣移植是臨床上修復重建常用的方法，是將皮瓣由身體一處轉移至另一處的過程，也是臨床上修復組織缺損和器官再造的重要方法[2-3]。但由于各種因素的影響，很多患者的皮瓣修復過程中容易出現皮瓣部分或全部壞死，甚或出現皮瓣缺血再灌注損傷導致的皮瓣部分或全部壞死，導致皮瓣修復失敗[4]。皮瓣類型多種多樣，隨意型皮瓣屬于其中之一，其特點是使用靈活和簡單快捷等。隨意型皮瓣不含軸型血管，血供僅靠皮下的毛細血管網，在修復中的成活率比較低[5-6]。骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)存在于成人的骨髓組織中，具有多向分化潛能，也能夠能夠自我復制，能夠分化為同為中胚層的成骨細胞、軟骨細胞等，提示在皮瓣修復中可能存在重要的價值[7-8]。研究[9]表明BMSCs除能分化為多種參與血管形成的細胞外，還能分泌血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等因子，從而促進血管再生，改善局部血供。本研究通過動物實驗探討BMSCs通過增加血管生成和VEGF表達影響大鼠隨意型皮瓣存活的效果，以促進BMSCs的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠(48只)購自西安交通大學實驗動物中心，2～3月齡，體重200～250 g，許可證號：SYXK(陜)2020-005。嚴格遵守相關標準進行飼養，定量喂食，自由飲水，無其他不良因素。本研究得到了本院動物倫理委員會的批準。所有動物在實驗過程中都符合倫理原則。

1.2 細胞與主要試劑 大鼠BMSCs來自本院實驗室。丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號分別為S0131S、S0109、P0012S)均購自上海碧云天生物科技有限公司；VEGF單克隆抗體、山羊抗鼠多克隆抗體(批號分別為ab32152、ab150113)均購自英國Abcam公司；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM細胞培養液(批號分別為S9020、T8150、31600)均購自Solarbio公司。

1.3 大鼠隨意型皮瓣模型的建立 所有大鼠適應性飼養1周，適應實驗室環境后開始進行實驗。將大鼠置于俯臥位，固定在手術臺上，腹腔注射10.0%水合氯醛3.0 ml/kg。將其背部剪毛、脫毛后用碘伏消毒，鋪巾。將大鼠背部兩髂嵴連線處作為蒂，于背部正中采用甲紫設計矩形隨意皮瓣(3 cm×9 cm)，沿設計線切開皮膚和皮下組織，保留真皮下毛細血管網，達深筋膜淺層。結扎創面較活躍出血點，蒂在尾側，距尾端約1.5 cm，完全掀起皮瓣后止血。間斷原位縫合，用聚維酮碘消毒切口周圍后涂抹抗生素軟膏。采用頭頸固定器固定大鼠，使大鼠不能破壞皮瓣模。

1.4 動物分組與處理 將隨意型皮瓣模型大鼠隨機平分為模型組、小劑量BMSCs組和大劑量BMSCs組。模型組在背部肌肉深筋膜8個不同點(每個點相隔1 cm左右)注射0.4 ml磷酸鹽緩沖液，小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組于相同部位注射等體積的BMSCs完全培養液(細胞濃度分別為2×108個/L和20×108個/L)。BMSCs用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養液培養，采用磷酸鹽緩沖液重懸。三組均每2 d注射1次，持續28 d。

1.5 觀察指標 ①觀察與記錄所有大鼠的隨意型皮瓣形態，包括皮瓣顏色、質地、組織彈性、壞死面積等。采用數碼相機進行皮瓣攝像，精確測量皮瓣存活部分及壞死部分面積。皮瓣壞死標準：病理表現為組織回縮、組織崩解、細胞核消失，彈性差，質地堅硬，切割組織不出血，炎癥細胞廣泛浸潤，皮瓣顏色發黑。皮瓣存活率=皮瓣存活表面積/皮瓣總表面積×100.0%。②取皮瓣遠端標本(在成活區距成活與壞死交界處0.5 cm)，制成10.0%水相組織勻漿，2000 r/min離心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱，采用相應試劑盒檢測上清液中SOD和MDA水平。③取大鼠尾靜脈血1 ml，2000 r/min離心10 min(離心溫度為4 ℃)，用酶聯免疫法檢測血清基質金屬蛋白酶9(MMP-9)與基質細胞衍生因子-1(SDF-1)水平。④在治療第28、56天各組分別處死8只大鼠，將隨意型皮瓣樣本置于干冰上，剪碎后使用電動勻漿器進行組織勻漿，裂解蛋白后于4 ℃條件下10000 r/min離心5 min，收集上清。蛋白濃度測定使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行：取20 μg蛋白進行蛋白電泳，濕法轉膜，用溶解有5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液(TBST)封閉1 h；加入VEGF一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜(3次)后加入二抗，室溫反應1 h；TBST洗膜(3次)，進行蛋白曝光顯色分析。

2 結 果

2.1 三組大鼠皮瓣存活率比較 見表1。小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組治療第7、14、28天的皮瓣存活率高于模型組，且大劑量BMSCs組皮瓣存活率高于小劑量BMSCs組(均P<0.05)。

表1 三組大鼠皮瓣存活率比較(%)

2.2 三組大鼠皮瓣SOD和MDA水平比較 見表2。小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組治療第7、14、28天的皮瓣SOD水平高于模型組，MDA水平低于模型組(均P<0.05)。小劑量BMSCs組治療第7、14、28天的皮瓣SOD水平低于大劑量BMSCs組，MDA水平高于大劑量BMSCs組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠皮瓣SOD和MDA水平比較

2.3 三組大鼠血清MMP-9與SDF-1水平比較 見表3。小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組治療第7、14、28天的血清MMP-9與SDF-1水平高于模型組，且大劑量BMSCs組MMP-9與SDF-1水平高于小劑量BMSCs組(均P<0.05)。

表3 三組大鼠血清MMP-9與SDF-1水平比較(pg/ml)

2.4 三組大鼠皮瓣VEGF蛋白相對表達量比較 見表4。小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組治療第28、56天的皮瓣VEGF蛋白相對表達量高于模型組，且大劑量BMSCs組VEGF蛋白相對表達量高于小劑量BMSCs組(均P<0.05)。

表4 三組大鼠皮瓣VEGF蛋白相對表達量比較

3 討 論

皮膚移植是修復大面積皮膚缺損的常見方法，皮瓣組成包括皮膚和附著皮下組織，與本體相連的部分為皮瓣蒂部[10-14]。隨意皮瓣的長寬比在1∶1至3∶1之間，不受限于軸心血管走形和分布。隨意皮瓣的縱軸線方向與設計部位比較靈活多樣，操作相對簡便，但臨床上容易發生缺血壞死[15]。本研究顯示，小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組治療第7、14、28天的皮瓣存活率高于模型組，且大劑量BMSCs組皮瓣存活率高于小劑量BMSCs組，表明BMSCs可提高大鼠隨意型皮瓣存活率。從機制上分析，BMSCs是來源于中胚層的干細胞，具有多向分化能力，可在具體損傷反應中大量分泌生長因子，從而促進各種病損的組織器官修復。研究[16]顯示BMSCs具有多向分化潛能，是組織修復的良好種子細胞，可以向其他胚層來源的細胞分化，能夠有效提高股骨頭內局部組織的成骨能力。研究[17]顯示BMSCs能分泌多種成骨活性因子，有利于骨折愈合時細胞爬行，以減低骨內壓，達到提高骨折愈合率的效果。影響皮瓣存活率的因素比較多，包括能量代謝障礙、血管內皮細胞功能障礙、自由基生成增多、鈣超載、細胞凋亡等[18]。MDA水平既能直接反映機體脂質過氧化的速率、強度，還可間接反映細胞受損情況。SOD是體內天然的抗氧化酶，也是機體抗氧化酶系統重要的抗氧化劑之一，可通過催化超氧陰離子自由基的自身氧化還原反應維持機體自由基的動態平衡，避免損傷機體的組織細胞[19]。本研究顯示，小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組治療第7、14、28天的皮瓣SOD水平高于模型組，MDA水平低于模型組，且小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組兩指標水平比較差異有統計學意義，表明BMSCs可提高大鼠的皮瓣SOD水平，降低MDA水平。研究[20]表明BMSCs分泌的基質細胞衍生因子可促進血管生成、上皮再生，從而促進小鼠放射傷口愈合及皮膚血管增生，進一步改善皮膚的修復質量。同時，BMSCs具有免疫調節作用，采集和擴增均較為方便，在臨床上的應用具有很好的推廣價值。

MMP-9是一種肽鏈內切酶，其可以降解細胞外基質，提高細胞因子的生物利用度，促進內皮祖細胞從骨髓中釋放至外周血[21]。SDF-1可介導機體的血管生產過程，增加缺血心肌組織SDF-1的表達，促進內皮祖細胞至缺血的心肌參與血管生成[22]。本研究顯示，小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組治療第7、14、28天的血清MMP-9與SDF-1水平高于模型組，且大劑量BMSCs組兩指標水平高于小劑量BMSCs組，表明BMSCs可提高大鼠血清MMP-9與SDF-1水平。研究[23]顯示，BMSCs能夠促進大鼠骨髓中內皮祖細胞的動員釋放，有利于外周血血管內皮祖細胞參與缺血組織血管形成，從而提高隨意皮瓣的存活率。

VEGF能夠直接誘導血管內皮細胞增生，也具有增加血管通透性等作用，還可以通過促進血漿蛋白在局部沉積為組織再生和新生血管長入提供細胞外基質，能促進局部微循環血管網的建立，促進成骨細胞的生長，誘導成骨細胞向壞死區轉移[24-25]。VEGF還可以促進血管內皮細胞分裂及抑制其凋亡，減輕皮瓣缺血再灌注損傷，有利于皮瓣形成新生血管和缺血皮瓣的再血管化，從而促進皮瓣成活[26]。本研究顯示，小劑量BMSCs組與大劑量BMSCs組治療第28、56天的皮瓣VEGF蛋白相對表達量高于模型組，且大劑量BMSCs組VEGF蛋白相對表達量高于小劑量BMSCs組。從機制上分析，VEGF能促進已存在的血管出芽生長，緩解皮瓣組織水腫，減少炎性細胞浸潤，增強皮瓣抗感染能力。BMSCs能夠提高自由基清除酶的活性，增強抗氧化能力，還能在損傷局部反應性分泌VEGF，通過自身分化為內皮細胞和血管平滑肌細胞改善缺血缺氧狀態，直接生成新的血管來供應缺血部位，減輕氧化應激[27]。

綜上所述，BMSCs可提高大鼠血清MMP-9與SDF-1水平，增加皮瓣SOD水平，降低MDA水平，有利于提高VEGF的表達，從而增加隨意型皮瓣存活率。但研究也存在一定的不足，沒有進行細胞學分析，也沒有納入空白對照組，將在后續研究中進一步探討。