依普利酮通過靶向微小RNA-192和微小RNA-29a/b/c減輕糖尿病腎病模型大鼠腎損傷機制研究

袁 瑾，趙 燦，張渭濤

(1.西安市第一醫院腎內科，陜西 西安 710002；2.西安市第一醫院內分泌科，陜西 西安 710002)

糖尿病是一種復雜的代謝性疾病，特點是高血糖和胰島素功能障礙[1]。糖尿病患者動脈粥樣硬化性心血管、外周動脈和腦血管疾病的發生率和風險很高[2]。然而，發生并發癥的風險受到許多因素的影響，包括糖尿病持續時間和遺傳因素。作為糖尿病的終末階段，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是一種進行性腎臟疾病，也是糖尿病患者死亡的主要原因[3]。DN可能導致終末期腎衰竭，其特征是蛋白尿和腎小球濾過率下降，可導致尿毒癥[4]。DN的危險因素很多，如尿白蛋白排泄增加、葡萄糖水平升高、血脂異常、肥胖、高齡、腎小球高濾過和遺傳因素[5]。DN進展由三個過程組成，即腎小球肥大和高濾過、腎小球和腎小管間質區域炎癥以及細胞外基質的積累[6]。腎臟功能和結構的變化是導致終末期腎病的主要因素。因此，有必要更好地了解導致和參與糖尿病并發癥的機制，以改進目前對這種多因素和復雜疾病的治療策略[7-8]。一些研究引入了一個新的內源性小(約22個核苷酸)單鏈非編碼RNA分子家族，稱為微小RNA(microRNA，miR)，作為僅在人類中的發育調節劑[9]。這些分子通過在轉錄后抑制基因表達來調節生理和病理過程，并在疾病發展中發揮關鍵作用。有研究[10]指出，microRNA在DN各個階段發揮作用，作為早期確定該疾病的生物標志物，強調了microRNA表達水平變化與糖尿病并發癥之間的相關性。鑒于microRNA在多種疾病(如糖尿病、腎病、糖尿病腎病等)發病機制中的重要性，研究在DN中發生改變的不同microRNA的表達水平具有非常重要的意義[11]。依普利酮作為醛固酮拮抗劑和抗高血壓藥物，不僅耐受性良好，還影響尿白蛋白并降低DN患者血壓[12]。本研究旨在探討依普利酮通過靶向miR-192和miR-29a/b/c減輕DN模型大鼠腎損傷的機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只成年雄性SD大鼠，鼠齡9周，體重220～250 g，購自西安交通大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(陜)2020-005。將大鼠圈養在無特定病原體(SPF)級實驗室，溫度控制在(25±2)℃，12 h光/暗循環，期間大鼠可自由獲取食物和水。定期觀察體重、食物消耗和飲水量變化，適應環境2周。所有動物研究根據美國國立衛生研究院《實驗室動物護理和使用指南》進行。

1.2 主要試劑 抗轉化生長因子β1(TGF-β1)(批號：ab92486)、抗Smad家族蛋白3(Smad3)(批號：ab40854)、抗Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)(批號：ab6308)、抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(批號：ab32575)和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(批號：ab8245)、IgG二抗(批號：ab6721、ab190475)均購自Abcam公司；依普利酮(批號：DST190124-015)購自成都樂美天醫藥；硫噴妥鈉(國藥準字H31021846)購自上海新亞藥業有限公司；cDNA合成試劑盒購自高原生物科技有限公司；5%牛血清白蛋白、TRIzol試劑/Light Cycler 480檢測系統及SYBR Green染料均購自賽默飛世爾科技有限公司；反轉錄酶試劑盒購自Takara公司；尿蛋白試劑盒、肌酐測定試劑盒和尿素測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Micro BCA蛋白質測定試劑盒購自中國優迪生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DN大鼠模型建立、分組及標本收集：將大鼠隨機分為對照組、模型組、依普利酮組，每組10只。將新鮮制備的鏈脲佐菌素(STZ)溶解在0.1 mol/L、pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液中，單次腹腔注射劑量為60 mg/kg，以誘導DN大鼠模型。為防止完全破壞胰島B細胞，在STZ注射液中溶解110 mg/kg煙酰胺。誘導72 h后，若空腹血糖>16.7 mmol/L、尿糖呈強陽性且尿量大于對照組50%，則表示建模成功[13-14]。對照組注射等體積0.9%氯化鈉溶液和檸檬酸鹽緩沖液。依普利酮組在模型組基礎上每天管飼100 mg/kg依普利酮，持續8周。實驗結束后，收集大鼠24 h尿液樣本，儲存于-80 °C，用于實驗分析總蛋白和肌酐水平。采用40 mg/kg硫噴妥鈉腹腔注射麻醉，心臟穿刺放血，分離樣本取上清，分離腎組織，-80 °C儲存，用于后續實驗。

1.3.2 腎組織基因表達檢測：使用TRIzol試劑從大鼠勻漿腎組織中提取總RNA，使用cDNA合成試劑盒合成cDNA，應用Light Cycler 480檢測系統和SYBR Green染料進行實時定量PCR(RT-qPCR)以評估microRNA的mRNA表達水平。使用反轉錄酶試劑盒在37 °C下進行cDNA反轉錄15 min。熱循環條件：在92 °C初始變性4 min，90 °C 15 s和 60 °C 30 s循環40次。應用Primer Express 2.0軟件設計引物，GAPDH mRNA和U6小核RNA水平用于標準化，循環閾值分析RT-qPCR數據并表示為相對microRNA或mRNA水平，用2-ΔΔCT方法將其轉換為倍數變化值。

1.3.3 生化標志物測定：從大鼠心臟收集血液樣本，通過比色法測量血清葡萄糖濃度。使用尿蛋白試劑盒測定尿蛋白水平。采用肌酐測定試劑盒和尿素測定試劑盒測定肌酐和血尿素氮水平。使用酶標儀通過酶聯免疫吸附(ELISA)法測定TGF-β1水平。根據腎小球濾過率(GFR)=UCr·V/PCr·1440(U指尿液，Cr指肌酐，P指血漿，V指24 h尿液)測量GFR。

1.3.4 蛋白質印跡分析：采用放射免疫沉淀測定緩沖液中裂解收集的腎組織。應用BCA蛋白試劑盒定量，每個樣品上樣50 μg，進行電泳。將細胞轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用6%脫脂奶粉在37 °C下封閉1 h。依據分子量大小裁剪雜交膜，分別與抗TGF-β1(1∶200)、抗Smad3(1∶1000)、抗Col Ⅰ(1∶500)、抗α-SMA(1∶1000)和抗GAPDH(1∶1000)37 °C條件下孵育2 h，與辣根過氧化物酶偶聯羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)37 ℃條件下孵育1 h。使用化學發光蛋白質印跡底物檢測免疫印跡，可視化后進行抗體孵育。采用Chemi Doc MP Image分析系統掃描和定量蛋白質條帶。

1.3.5 腎臟組織學檢查：使用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)室溫固定腎組織20 min，石蠟包埋，切成3 μm厚的切片。然后進行蘇木精和伊紅(HE)染色(室溫，20 min)，使用Olympus倒置顯微鏡(×400)觀察。

1.3.6 免疫組化分析：將3 μm腎組織切片脫石蠟(二甲苯和梯度乙醇)、再水化后，用微波輻射將其煮沸15 min，在檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)中進行抗原修復。用PBS洗滌切片3次，室溫下用5%牛血清白蛋白封閉30 min，加入抗TGF-β1(1∶200)、抗Smad3(1∶1000)、抗Col Ⅰ(1∶500)、抗α-SMA(1∶1000)和抗GAPDH(1∶1000)37 °C條件下孵育2 h，與辣根過氧化物酶偶聯羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)37 ℃條件下孵育1 h。使用Olympus倒置光學顯微鏡進行目視分析，計算平均光密度(MOD)。

2 結 果

2.1 三組大鼠腎臟組織microRNA的mRNA表達水平比較 見表1。模型組miR-29a、miR-29b、miR-29c的mRNA表達水平低于對照組，miR-192的mRNA表達水平高于對照組(均P<0.05)。依普利酮組miR-29a、miR-29b、miR-29c的mRNA表達水平高于模型組，miR-192的mRNA表達水平低于模型組(均P<0.05)。

表1 三組大鼠腎臟組織microRNA的mRNA表達水平比較

2.2 三組大鼠體重、空腹血糖及腎臟質量/體重比較 見表2。模型組體重低于對照組，空腹血糖和腎臟質量/體重高于對照組(均P<0.05)。依普利酮組體重高于模型組，空腹血糖和腎臟質量/體重低于模型組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠體重、空腹血糖及腎臟質量/體重比較

2.3 三組大鼠生化指標比較 見表3。模型組尿蛋白、肌酐和血尿素氮水平高于對照組，而依普利酮組低于模型組(均P<0.05)。

表3 三組大鼠生化指標比較

2.4 三組大鼠GFR比較 對照組、模型組和依普利酮組GFR分別為(33.62±4.58)ml/min、(24.45±2.67) ml/min 和(29.83±3.25)ml/min，三組比較差異有統計學意義(F=11.204，P=0.012)。此外，模型組GFR低于對照組，而依普利酮組高于模型組(均P<0.05)。

2.5 三組大鼠TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA和Smad3蛋白表達水平比較 見表4。蛋白質印跡分析結果顯示，模型組TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA和Smad3蛋白表達水平高于對照組，而依普利酮組低于模型組(均P<0.05)。

表4 三組大鼠TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA和Smad3蛋白表達水平比較

2.6 三組大鼠腎臟組織HE染色結果比較 見圖1。模型組基底膜變薄(藍色箭頭)，腎小球萎縮(黃色箭頭)，近曲小管損傷(綠色箭頭)。經依普利酮治療后，這些病理結構得到改善。

對照組 模型組 依普利酮組

2.7 三組大鼠TGF-β1、Smad3和α-SMA MOD比較 見表5。模型組TGF-β1、Smad3和α-SMA MOD高于對照組，而依普利酮組MOD低于模型組(均P<0.05)。

表5 三組大鼠TGF-β1、Smad3和α-SMA MOD比較

3 討 論

DN是糖尿病主要微血管并發癥，也是糖尿病患者病死主要原因。本研究發現依普利酮可以調控miR-192和miR-29a/b/c表達水平并逆轉DN大鼠腎損傷。在過去幾年中，microRNAs在腎臟疾病中的作用已被深入研究，并且由于其直接靶向細胞外基質基因的miR-29家族(miR-29a、miR-29b和miR-29c)，受到了廣泛關注。本研究表明，與對照組相比，模型組均質腎組織miR-29a/b/c表達水平降低，而用依普利酮治療DN大鼠可以顯著增加均質腎組織中miR-29a/b/c的表達水平，并降低miR-192的表達水平。miR-29a被引入作為微調膠原蛋白表達的抑制劑。因此，高葡萄糖/TGF-β1引起的miR-29a表達降低可導致近端小管細胞中過量膠原蛋白沉積的風險升高。近端腎小管細胞、原代系膜細胞和足細胞暴露于TGF-β1被證明會降低miR-29a/b/c的表達，其靶向膠原基因表達并增加細胞外基質蛋白的表達。研究[15]發現，高糖條件下2型糖尿病模型db/db小鼠腎內皮細胞和腎小球足細胞中miR-29c的表達增加，而敲除miR-29c可以防止DN進展。本研究結果表明，模型組腎臟組織提取物中miR-192表達水平高于對照組，經依普利酮治療后miR-192表達顯著降低。miR-192的下調有可能減少慢性腎病大鼠模型中Smad3介導的腎纖維化[16]。在體外模型研究中發現，miR-29a通過Smad3依賴性機制負調節一些纖維化基因，包括COL1A1、COL1A2和Ⅳ型膠原蛋白[17]。miR-29a表達在有腎功能障礙風險的患者的腎組織和患有腎纖維化的糖尿病嚙齒動物模型中顯著降低，提示DN腎組織中miR-29a/b/c表達增加可能通過靶向TGF-β1/Smad信號通路來改善DN。

本研究顯示，與對照組相比，模型組腎組織中miR-192表達水平顯著增加，而依普利酮治療可以降低腎組織miR-192表達水平。依普利酮治療8周后，與模型組相比，體重和腎臟重量均顯著升高，血糖降低，腎功能的生化指標(尿蛋白、肌酐、血尿素氮)也得到改善，腎臟病理變化減輕，表明依普利酮對DN具有治療作用。TGF-β1是一種主要的促纖維化因子，可驅動腎纖維化和DN發展[18]。TGF-β1激活Smad2和Smad3，它們是受Smad7負調控的兩個關鍵下游介質，以執行生物活動。研究表明，阻斷TGF-β1/Smad3信號通路是治療DN的有效方法。此外，已經確定過多的膠原沉積是腎纖維化的主要特征，并且TGF-β1信號在刺激Col Ⅰ表達中起重要作用。在DN進展過程中，由肌成纖維細胞表達的α-SMA位于腎間質并與系膜增殖有關[19]。本研究表明，依普利酮在體內可降低TGF-β1、Smad3、Col Ⅰ和α-SMA蛋白的表達，表明依普利酮可能是一種有效的DN治療藥物，其潛在機制可能為通過TGF-β1/Smad信號通路抑制過度增殖和腎纖維化。研究[20]表明，miR-192與DN的發病機制有關，并且miR-192在實驗性糖尿病的系膜細胞、腎小管上皮細胞和腎組織中富集。此外，有報道稱miR-192是體外腎纖維化中TGF-β1信號傳導的重要介質，且在腎纖維化過程中通過Smad3受到TGF-β1的嚴格調控。DN模型大鼠中miR-192表達上調，經依普利酮治療后表達下調，這伴隨著DN損傷和纖維化相關蛋白表達的減少，包括TGF-β1、Smad3、Col Ⅰ和α-SMA。有研究表明，TGF-β1可以通過miR-155信號通路阻礙Nephrin蛋白的表達并增強Desmin和Caspase-9的表達，抑制miR-155可減少TGF-β1處理的足細胞中的這些改變并減輕足細胞凋亡。

綜上所述，依普利酮通可減輕DN模型大鼠腎損傷，機制與靶向miR-192和miR-29a/b/c表達調控TGF-β1/Smad信號通路有關。