瑞馬唑侖對老年大鼠海馬B淋巴細(xì)胞瘤-2、一氧化氮合酶蛋白表達(dá)及神經(jīng)元凋亡和認(rèn)知功能的影響

趙 娟，陳金權(quán)

(1.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院麻醉手術(shù)中心，陜西 西安 710100；2.咸陽市第一人民醫(yī)院麻醉科,陜西 咸陽 712000)

隨著年齡的增加，老年人多伴隨有認(rèn)知功能障礙，其特征為認(rèn)知功能逐漸下降，也伴隨有各種神經(jīng)系統(tǒng)的指標(biāo)降低[1]。老年人的病理特征為老年斑，伴隨有淀粉樣蛋白沉積，特別是神經(jīng)元凋亡可導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，而且淀粉樣蛋白是凋亡過程的誘導(dǎo)因素[2]。在顱內(nèi)腦組織中，海馬神經(jīng)元是學(xué)習(xí)、記憶等高級神經(jīng)活動的重要部位，認(rèn)知功能障礙患者的海馬組織可受到傷害，導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶功能障礙[3]。海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)嗅區(qū)可通過穿通道與齒狀回顆粒細(xì)胞形成突觸聯(lián)系，然后與CA1錐體細(xì)胞、CA3錐體細(xì)胞形成突觸聯(lián)系[4]。理想的鎮(zhèn)靜藥物應(yīng)具有不良反應(yīng)發(fā)生率低、起效快、順行性遺忘、停藥后能迅速恢復(fù)、對呼吸循環(huán)抑制小等特點(diǎn)[5]。咪達(dá)唑侖為臨床上比較常用的全身麻醉誘導(dǎo)及輔助性鎮(zhèn)靜藥，但其在臨床應(yīng)用中容易出現(xiàn)代謝物殘留，使麻醉蘇醒期延長，對機(jī)體的認(rèn)知功能有一定的負(fù)面影響[6-7]。瑞馬唑侖為一種新型超短效苯二氮卓類藥物，是在咪達(dá)唑侖結(jié)構(gòu)上引入一個可以代謝的丙酸甲酯側(cè)鏈的產(chǎn)物，其可降低神經(jīng)元的興奮性，還可作用于γ-氨基丁酸A型受體，引起機(jī)體活動減少，神經(jīng)細(xì)胞膜氯離子通道開放頻率增加，從而使神經(jīng)元產(chǎn)生抑制作用[8]。本研究探討瑞馬唑侖對老年大鼠海馬B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-lymphoma-2，Bcl-2)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)蛋白表達(dá)及神經(jīng)元凋亡和認(rèn)知功能的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級3月齡雄性SD大鼠45只購自南京君科生物工程有限公司，飼養(yǎng)于本院實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號：20984211)，雌雄不限，體重200～220 g。所有大鼠于清潔動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，操作過程符合動物倫理要求，每籠4只大鼠，實(shí)驗(yàn)室溫度20～28 ℃，相對濕度50%～60%，通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水，12 h黑暗與12 h照明交替。大鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周。本研究得到了實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。瑞馬唑侖(國藥準(zhǔn)字H20200006)購自人福藥業(yè)，咪達(dá)唑侖(國藥準(zhǔn)字H10980025)購自恩華藥業(yè)。通道式水迷宮由黑色有機(jī)玻璃制成(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所研制)。顱腦立體定位儀購自西北光學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 老年大鼠模型的建立：所有大鼠都給予腹腔注射D-半乳糖建立亞急性衰老模型，以0.9%氯化鈉溶液配制1.25% D-半乳糖溶液，依照50 mg/(kg·d)的標(biāo)準(zhǔn)量對大鼠進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)注射6周。在造模完成后，對存活的大鼠進(jìn)行水迷宮行為學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)有行為學(xué)改變的大鼠39只，即建模成功。

1.2.2 大鼠分組與處理：將39只亞急性衰老大鼠隨機(jī)平分為模型組、咪達(dá)唑侖組、瑞馬唑侖組。咪達(dá)唑侖組、瑞馬唑侖組分別經(jīng)尾靜脈持續(xù)輸注咪達(dá)唑侖6 mg/kg、瑞馬唑侖6 mg/kg，持續(xù)7 d，每天輸注8 h。模型組用同樣方法輸注等劑量0.9%氯化鈉溶液。

1.3 觀察指標(biāo) ①M(fèi)orris水迷宮實(shí)驗(yàn)：記錄第1、3、7天大鼠逃避潛伏期時間，于第7天檢測穿越平臺次數(shù)，評估大鼠認(rèn)知功能。②所有大鼠在處理第1、3、7天采集尾靜脈血0.2 ml，不抗凝，靜置30 min，3000 r/min高速離心10 min，取上清液檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性與丙二醛(MDA)含量。③各組大鼠恢復(fù)清醒后置于動物房，麻醉后處死，取海馬組織制成病理切片，采用TUNEL法檢測CA1與CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)。④取大鼠海馬組織，在4 ℃研磨后加入蛋白裂解液提取總蛋白，定量蛋白濃度后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，孵育的一抗包括抗Bcl-2抗體、抗NOS抗體(稀釋度為1∶1000)，二抗稀釋度為1∶5000，采用ECL進(jìn)行顯色，以β-actin為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠不同時間點(diǎn)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見表1。處理后第3、7天，咪達(dá)唑侖組和瑞馬唑侖組逃避潛伏期高于模型組，且瑞馬唑侖組低于咪達(dá)唑侖組(均P<0.05)；咪達(dá)唑侖組和瑞馬唑侖組穿越平臺次數(shù)低于模型組，且瑞馬唑侖組高于咪達(dá)唑侖組(均P<0.05)。

表1 三組大鼠不同時間點(diǎn)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 三組大鼠不同時間點(diǎn)血清SOD活性與MDA含量比較 見表2。處理后第3、7天，咪達(dá)唑侖組和瑞馬唑侖組血清SOD活性高于模型組，MDA含量低于模型組(均P<0.05)；瑞馬唑侖組血清SOD活性高于咪達(dá)唑侖組，MDA含量低于咪達(dá)唑侖組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠不同時間點(diǎn)血清SOD活性與MDA含量比較

2.3 三組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較 見表3。處理后第7天，咪達(dá)唑侖組、瑞馬唑侖組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)低于模型組，且瑞馬唑侖組低于咪達(dá)唑侖組(均P<0.05)。

表3 三組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較(%)

2.4 三組大鼠海馬Bcl-2、NOS蛋白相對表達(dá)水平比較 見表4。處理后第7天，咪達(dá)唑侖組和瑞馬唑侖組海馬Bcl-2、NOS蛋白相對表達(dá)水平高于模型組，且瑞馬唑侖組高于咪達(dá)唑侖組(均P<0.05)。

表4 三組大鼠海馬bcl-2、NOS蛋白相對表達(dá)水平比較

3 討 論

隨著年齡的增加，老年人多伴隨有認(rèn)知行為損害，可導(dǎo)致腦組織病理改變。腹腔注射D-半乳糖建立的亞急性衰老模型可使得外源性β-淀粉樣蛋白出現(xiàn)局灶性壞死，引起神經(jīng)元丟失與膠質(zhì)增生，導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)功能減退[9]。同時，大鼠海馬神經(jīng)元損傷可伴隨神經(jīng)元數(shù)量減少、膠質(zhì)細(xì)胞增生、炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞減少[10]。瑞馬唑侖為一種水溶性超短效麻醉鎮(zhèn)靜藥物，可抑制神經(jīng)元的電活動，還可經(jīng)非特異性血漿酯酶水解代謝。瑞馬唑侖在臨床上的應(yīng)用具有對相關(guān)受體親和力低、血流動力學(xué)平穩(wěn)、起效快速等特點(diǎn)[11]。并且，瑞馬唑侖代謝產(chǎn)物基本上無活性，經(jīng)腎臟排泄，對相關(guān)受體親和力低，因而對循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響較小[12]。本研究顯示，處理后第3、7天咪達(dá)唑侖組和瑞馬唑侖組逃避潛伏期均高于模型組，且瑞馬唑侖組低于咪達(dá)唑侖組；咪達(dá)唑侖組和瑞馬唑侖組穿越平臺次數(shù)低于模型組，且瑞馬唑侖組高于咪達(dá)唑侖組。提示瑞馬唑侖、咪達(dá)唑侖都可降低大鼠認(rèn)知功能，但與咪達(dá)唑侖相比，瑞馬唑侖對老齡大鼠的認(rèn)知功能影響較小。另外，處理后第3、7天，咪達(dá)唑侖組、瑞馬唑侖組血清SOD活性高于模型組，MDA含量低于模型組；瑞馬唑侖組血清SOD活性高于咪達(dá)唑侖組，MDA含量低于咪達(dá)唑侖組。從機(jī)制上分析，SOD為消除氧自由基的重要抗氧化酶，能通過歧化反應(yīng)催化體內(nèi)對人體有害的超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣，清除代謝廢物[13]；SOD活性降低可引起氧自由基不斷堆積，導(dǎo)致腦神經(jīng)元受到損傷。MDA可以反映機(jī)體內(nèi)部脂質(zhì)過氧化物堆積程度，也能反映體內(nèi)自由基清除能力[14]。瑞馬唑侖是在咪達(dá)唑侖的基礎(chǔ)上研發(fā)的，具有更好的有效性和安全性，麻醉效果更好，且瑞馬唑侖還可作用于γ-氨基丁酸受體來降低神經(jīng)元興奮，體內(nèi)無蓄積且滯留時間短于咪達(dá)唑侖，能促使大鼠少動，從而發(fā)揮更好的鎮(zhèn)靜效應(yīng)。瑞馬唑侖可提高組織氧化酶活性，減少自由基損傷，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)海馬組織神經(jīng)細(xì)胞[15]。

海馬結(jié)構(gòu)是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，老年大鼠多伴有氧化應(yīng)激損傷，是觸發(fā)神經(jīng)元損傷的主要誘因，也是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加的重要因素[16]。本研究顯示，處理后第7天咪達(dá)唑侖組、瑞馬唑侖組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)低于模型組，且瑞馬唑侖組低于咪達(dá)唑侖組。從機(jī)制上分析，瑞馬唑侖能快速作用于γ-氨基丁酸A型受體，使氯離子通道開放，氯離子內(nèi)流，引起神經(jīng)細(xì)胞膜發(fā)生超極化[17]。瑞馬唑侖還能抑制促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇的表達(dá)，可通過抑制細(xì)胞因子分泌和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖來影響免疫細(xì)胞功能，從而抑制神經(jīng)元電活動，也可抑制神經(jīng)元凋亡[18]。

Bcl-2在各種損傷所致的神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用，主要分布于核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體膜、線粒體內(nèi)膜上。Bcl-2具有消除自由基、抗氧化、抗衰老等作用，可抵御過氧化物對細(xì)胞膜的損害和干擾，對細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)維持和功能保護(hù)具有一定的作用[19]。NOS是催化生成內(nèi)源性一氧化氮的唯一酶類，在大鼠海馬結(jié)構(gòu)各區(qū)、各層均有分布，可能是參與學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的關(guān)鍵酶，能促進(jìn)機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶[20]。而且，NOS能使機(jī)體對鈣離子敏感性增加，導(dǎo)致突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加。本研究顯示，處理后第7天咪達(dá)唑侖組、瑞馬唑侖組海馬Bcl-2、NOS蛋白相對表達(dá)水平高于模型組，且瑞馬唑侖組高于咪達(dá)唑侖組，表明瑞馬唑侖在老年大鼠的應(yīng)用能促進(jìn)海馬Bcl-2、NOS蛋白表達(dá)，與文獻(xiàn)[21]報道一致。從機(jī)制上分析，瑞馬唑侖具有起效快、停藥后能迅速恢復(fù)等特點(diǎn)，并且其不依賴肝腎代謝，消除了器官依賴性，從而有利于維護(hù)大鼠的海馬神經(jīng)元功能[22]。

綜上所述，瑞馬唑侖能促進(jìn)老年大鼠海馬Bcl-2、NOS蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡，對大鼠認(rèn)知功能影響較小。