微小RNA-141和Yes相關蛋白1在胃癌組織中的表達及其對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響

張 俊，張麗秋，姜登鴿，楊彩豐，趙 鵬，朱玉俠，馬文兵

(1.西安市第一醫院消化內科，陜西 西安 710002；2.西安交通大學第一附屬醫院消化內科，陜西 西安 710061)

胃癌是目前全球發病率較高的惡性腫瘤之一[1]，其發病率常年位居惡性腫瘤發病率前列，且由于早期胃癌臨床癥狀并不明顯，患者接受治療時多已處于中晚期，因而預后較差[2-3]。數據顯示，我國胃癌病死例數約占全球胃癌病死總數的40%[4]，即使患者接受了根治性手術及放化療干預，5年生存率仍然僅為35%～40%[5]。有研究[6]指出，該結果與胃癌的異質性及非個體臨床治療有關。多數醫務工作者認為，早期干預和治療是改善胃癌患者預后的重要前提，但傳統病理檢測取樣困難，檢測周期長，實施難度較大。近些年隨著生物醫學的不斷進步，多種生物學指標在各類惡性腫瘤的監測中發揮了重要作用。研究[7-8]表明，微小RNA-141(microRNA-141，miRNA-141，miR-141)在乳腺癌、卵巢癌、腎癌等腫瘤組織中呈現低表達態，提示該因子可能參與了惡性腫瘤的發展進程。Yes相關蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1)是Hippo通路的下游信號分子，已有研究[9-10]證實其具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用。本研究探究miR-141和YAP1在胃癌組織中的表達情況，同時分析它們對胃癌細胞增殖的影響，以期為胃癌治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年5月至2021年5月于我院行胃癌手術的40例患者為研究對象，其中男性23例，女性17例；年齡43～68歲，平均(60.18±3.20)歲；腫瘤直徑<5 cm者24例，≥5 cm者16例；TNM分期Ⅰ-Ⅱ期15例，Ⅲ-Ⅳ期25例；浸潤黏膜下各層16例，浸潤漿膜層24例；出現淋巴結轉移14例，無淋巴結轉移26例。病例納入標準：均經病理學確診；均為初次患胃癌；采用根治性或姑息性手術切除，且術前未接受抗腫瘤治療；隨訪資料完整齊全。排除標準：合并其他惡性腫瘤者；妊娠或哺乳期女性；調研前接受放療者；并發其他影響調研結果疾病者。患者及其家屬對本研究均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 胃癌組織及癌旁組織miR-141和YAP1表達水平檢測：使用TRIzol試劑(購自上海西格生物科技有限公司)自40例胃癌及癌旁組織樣本中提取總RNA，使用Trans Gen Biotech試劑盒(批號：20190921，購自泉州市睿信生物科技有限公司)反轉錄為cDNA，然后開展實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析，檢測miR-141表達量。使用福爾馬林固定采集的胃癌及癌旁組織，石蠟包埋后連續4 μm切片，采用免疫組化法檢測受試組織中YAP1表達情況[試劑盒(批號：20201011)購自上海澤葉生物科技有限公司]。連續檢測3次并取平均值作為最終結果。

1.2.2 細胞培養及干預：使用恒溫水浴箱于37 ℃條件下將SGC-7901細胞系(由河北醫科大學第四醫院科研中心提供)復蘇，然后加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基(購自上海博湖生物科技有限公司)中，離心后將細胞轉移至細胞培養瓶，開始細胞孵育。光學顯微鏡下觀察細胞生長融合度達到80%以上后進行細胞傳代。傳代完成后實施細胞轉染。將細胞分為陰性對照組、miR-141模擬物轉染組(miR-141 mimics組)、miR-141抑制載體組(miR-141 inhibitors組)和YAP1沉默物siRNA YAP1組(siRNA YAP1組)，于37 ℃條件下繼續培養72 h。

1.3 觀察指標 ①比較胃癌組織及癌旁組織中miR-141和YAP1表達水平；②分析miR-141、YAP1表達情況同胃癌患者臨床病理特征如性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、浸潤深度等指標的相關性；③采用MTT實驗分析miR-141及YAP1對胃癌SGC-7901細胞增殖能力的影響：分別于12、24、48、72 h在各組細胞中加入20 μl MTT，37 ℃孵育4 h后加入150 μl DMSO，使用酶標儀檢測細胞在570 nm處的吸光度。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件對研究數據開展分析。計量資料用均數±標準差表示，進行正態分布及方差齊性檢驗，對滿足正態分布及方差齊性的數據組間比較采用t檢驗，方差不齊的數據應用非參數檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗進行統計推斷，對組間計數資料比較使用卡方檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中miR-141與YAP1相對表達水平比較 見表1。胃癌組織中miR-141表達水平明顯低于癌旁組織，YAP1蛋白表達水平明顯高于癌旁組織(均P<0.05)。

表1 胃癌組織與癌旁組織miR-141與YAP1相對表達水平比較

2.2 miR-141、YAP1表達水平與胃癌患者臨床病理特征相關性分析 見表2。miR-141表達水平與胃癌患者組織分化程度及TNM分期存在明顯相關性(均P<0.05)，與胃癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結轉移無明顯相關性(均P>0.05)。YAP1表達水平與胃癌患者TNM分期、腫瘤直徑及組織分化程度相關(均P<0.05)，與胃癌患者性別、年齡、浸潤深度、淋巴結轉移無明顯相關性(均P>0.05)。

表2 miR-141、YAP1表達水平與胃癌患者臨床病理特征相關性分析

2.3 miR-141對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響 見圖1。在24、48、72 h三個時間點，與陰性對照組比較，轉染miR-141模擬物后，胃癌SGC-7901細胞活力出現明顯降低，而轉染miR-141抑制劑后胃癌SGC-7901細胞活力出現明顯升高(均P<0.05)。

2.4 YAP1對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響 見圖1。在24、48、72 h三個時間點，與陰性對照組比較，轉染YAP1沉默物siRNA YAP1的胃癌SGC-7901細胞活力出現明顯降低，細胞遷移和侵襲能力明顯下降(均P<0.05)。

注：同一時間點三組比較，#P<0.05

3 討 論

胃癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤[11-12]。數據顯示我國胃癌早期診斷率大多低于10%，有70%～80%確診患者均為胃癌進展期，往往預后較差[13]。2018年全球惡性腫瘤統計數據[7]顯示，胃癌患病率位居除非黑色素瘤皮膚癌外的第5位，病死率居腫瘤第3位，東亞地區胃癌患病率位居首位，遠超西方國家。我國是胃癌主要集中地區之一，據國家癌癥中心數據[14]顯示，男性胃癌患病率僅次于肺癌位居第2位，病死率居同期惡性腫瘤第3位；女性胃癌患病率居第4位，病死率僅次于乳腺癌居第2位。雖然當前我國胃癌患者5年生存率已由2000年的30.2%提高至35.9%，但相較日本、韓國等地的60.3%、68.9%仍有較大差距[15]。當前胃癌發病機制尚不清晰，已有研究證實癌基因過度激活、抑癌基因失活以及相關炎癥因子動態失衡可能是導致胃黏膜細胞過度增殖出現惡性變的主要原因[16]，當前臨床上應用的諸如CEA、CA199等腫瘤標志物因特異性較差，僅能作為胃癌治療和診斷的參考指標[17]。近些年生物科學的進步使非編碼RNA、特異性蛋白等在胃癌診治中的應用愈加廣泛[18]，成為下一步胃癌靶向治療的重點研究方向。

本研究通過設立對照分組的方式，就miR-141、YAP1在胃癌組織中的表達情況進行了分析，結果顯示，相較于癌旁組織，胃癌組織中miR-141明顯低表達，而YAP1明顯高表達。miRNAs是一種長度在21～25 nt的單鏈非編碼RNA，能夠通過與靶基因結合發揮促進或抑制靶基因mRNA表達，進而調控轉錄進程效果的基因[19]。miRNAs具有強大的生物學功能，研究[20]證實miRNAs在大多數腫瘤中均會出現異常表達，可能對腫瘤的發生和發展發揮著極其重要的作用，因而miRNAs也可能成為新的腫瘤靶向治療靶點。miR-141是miR200家族中的一員，研究[21]證實miR-141會在上皮性卵巢癌細胞中高表達，而在胃癌細胞中低表達，本研究結果證實了這一點。進一步的研究指出，miR-141表達水平還可能與胃癌患者的臨床病理特征明顯相關，具體體現在胃癌組織分化程度及TNM分期中，該結果說明miR-141表達可能與胃癌進展、轉移以及分化密切相關，這一方面為胃癌的鑒別診斷提供了新的思路，另一方面也為胃癌的靶向治療提供了新的方向。YAP1是Hippo通路的下游信號因子。研究[10]指出Hippo通路可以通過磷酸化負性調節YAP1，進而影響YAP1蛋白表達，該現象在人類多種腫瘤如結腸癌、直腸癌中均有體現。還有研究[22]指出，YAP1過表達可以協同β-catenin促進腸道干細胞及腫瘤細胞的增殖，這可能也是YAP1在多種腫瘤中出現過表達的重要原因。本研究結果證實了YAP1在胃癌組織中呈現過表達這一現象，同時還發現YAP1表達同胃癌TNM分期、腫瘤直徑以及組織分化程度相關，這同樣為胃癌的診治提供了一定的參考。

本研究最后通過細胞實驗方式觀察了miR-141、YAP1是如何對胃癌細胞生物學行為產生影響的。研究中將SGC-7901細胞分為陰性對照組、miR-141模擬物轉染組(miR-141 mimics組)、miR-141抑制載體組(miR-141 inhibitors組)、YAP1沉默物siRNA YAP1組(siRNA YAP1組)，并選擇不同物質對其進行了轉載培養。觀察發現，轉染miR-141模擬物后，胃癌SGC-7901細胞活力明顯降低，而轉染miR-141抑制劑后胃癌SGC-7901細胞活力出現明顯升高，這說明miR-141具有抑制胃癌細胞增殖的作用，其原因分析可能為miR-141可通過靶向調控信號轉導因子和轉錄激活因子發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用[23]。而轉染YAP1沉默物siRNA YAP1的胃癌SGC-7901細胞活力明顯降低，細胞遷移和侵襲能力明顯下降，說明YAP1過表達能夠加速胃癌細胞增殖進程[24]。

綜上所述，胃癌組織中miR-141低表達，YAP1高表達，且兩者表達水平同胃癌SGC-7901細胞活性密切相關，可以考慮將miR-141和YAP1作為胃癌治療的新靶點應用于臨床。