微小RNA-195通過靶向BIRC5調控肝癌Hep3B細胞凋亡實驗研究

李玉龍，宗 偉，常素娥，陳思攀

(1.陜西省人民醫院消化內科，陜西 西安 710068；2.西安交通大學第二附屬醫院骨科，陜西 西安 710004；3.陜西省人民醫院介入放射科，陜西 西安 710068)

肝細胞癌是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發病呈增長趨勢[1-2]。肝癌的發生是一個復雜、多階段、涉及多因素的過程，包含原癌基因激活、抑癌基因失活、信號通路異常、腫瘤微環境改變、腫瘤細胞發生代謝重編程、表觀遺傳異常、免疫系統失調等。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)作為表觀遺傳學中的重要分子，引起了人們的廣泛關注。miRNA是一類內源性長度約22 nt的調節基因表達的非編碼RNA。肝癌中存在多種miRNA的異常表達，通過調控不同靶基因參與腫瘤增殖、遷移、侵襲、凋亡等過程[3]。miRNA可以作為預測肝癌的生物標志物，如miR-221[4]、miR-182[5]、 miR-375和miR-199a-3p[6]等。

miR-195位于17號染色體，在多種腫瘤中發揮抑癌基因作用，在肝癌組織及細胞系中的表達水平低于正常對照[7]。miR-195能夠靶向調控多種靶基因，如YAP[8]、AEG-1[9]、LATS2[10]等，發揮抑癌基因作用。在本研究中，我們將探討miR-195對人肝癌Hep3B細胞增殖及凋亡的影響及其可能涉及的分子機制，以期為肝癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌Hep3B細胞、HEK293細胞購自中國科學院細胞庫。Lipofectamine 2000 購自 Invitrogen公司，凋亡試劑盒購自上海七海復泰生物科技有限公司。小干擾RNA(siRNA)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，其中si-ctrl-S序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；si-ctrl-A序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；si-BIRC5-S序列為5’-GAAGAAAGAAUUUGAGGAATT-3’；si-BIRC5-A序列為5’-UUCCUCAAAUUCUUUCUUCTT-3’。報告基因由北京擎科生物科技有限公司合成，其中BIRC5 WT-S序列為5’-CTGCCTGTGCAGCGGGTGCTGCTGC-3’；BIRC5 WT-A序列為5’-TCGAGCAGCAGCACCCGCTGCACAGGCAGAGCT-3’；BIRC5 MT-S序列為5’-CTGCCTGTGCAGCGGGTGCACGAGC-3’；BIRC5 MT-A序列為5’-TCGAGCTCGTGCACCCGCTGCACAGGCAGAGCT-3’。

1.2 細胞培養 人肝癌Hep3B細胞及人胚胎腎細胞HEK293用含有10%胎牛血清的DMEM培養基，放于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中進行培養。

1.3 細胞轉染 將Hep3B細胞鋪入培養板，24 h后應用Lipofectamine 2000 分別轉染 miR-195、miR-ctrl、si-BIRC5及si-ctrl至Hep3B細胞，依次標記為miR-195組、miR-ctrl組、si-BIRC5組和si-ctrl組。

1.4 MTT實驗 將Hep3B細胞鋪入 96 孔培養板，按上述分組進行轉染。轉染后 24、48、72 h分別加入MTT，于37 ℃培養箱放置 4 h，取出后棄去液體加入150 ml DMSO溶解，用酶標儀測定 吸光度(OD)值。

1.5 細胞凋亡實驗 將Hep3B細胞計數鋪板，24 h后按照分組處理細胞。轉染24 h后，胰酶消化細胞，收集于15 ml離心管中，離心后棄上清，PBS沖洗細胞2～3次。棄去PBS，重新加入Binding Buffer重懸細胞，用FITC/PI雙染細胞，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 雙熒光報告基因實驗 生物信息軟件分析發現miR-195與BIRC5 3’-UTR區存在可能的結合位點，根據結合位點設計并合成BIRC5 3’-UTR(正常與突變)序列，構建pmirGLO-BIRC5(WT/MT)載體。實驗分為四組：無處理細胞組(對照組)，miR-195與pmirGLO空載體共轉染組，miR-195與pmirGLO-BIRC5-WT共轉染組(BIRC5-WT組)，以及miR-195與pmirGLO-BIRC5-MT共轉染組(BIRC5-MT組)。將HEK 293細胞接種于96孔板中，按上述分組進行轉染，24 h后進行熒光素報告實驗，檢測各處理組熒光素酶表達情況。

1.7 生物信息學分析 應用SangerBox數據分析平臺(http://sangerbox.com/)分析BIRC5在多種腫瘤中的表達，應用LinkedOmics[11]分析miR-195與BIRC5在肝細胞癌中的相關性。

1.8 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-195對肝癌Hep3B細胞增殖及凋亡的影響 見圖1。MTT實驗發現，與miR-ctrl組相比，miR-195組Hep3B細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。細胞凋亡實驗發現，Hep3B細胞過表達miR-195后細胞凋亡比例顯著高于對照組(P<0.05)，表明miR-195可促進Hep3B細胞凋亡。

注：與miR-ctrl組比較，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

2.2 miR-195靶基因分析 見圖2。應用Linked Omics網站分析發現，miR-195與BIRC5在肝細胞癌中呈負相關(P<0.05)。進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗檢測二者靶向關系，結果發現miR-195和pmirGLO-BIRC5-WT共轉染后與對照組相比熒光活性顯著降低，而miR-195與pmirGLO-BIRC5-MT共轉染組與對照組熒光活性比較差異無統計學意義(P>0.05)，表明miR-195可靶向作用BIRC5。

左圖為miR-195與BIRC5相關性分析；右圖為雙熒光素酶報告基因實驗結果，與對照組比較，#P<0.05

2.3 生物信息分析BIRC5在多種腫瘤中的表達情況 見圖3。生物信息學網站SangerBox分析基于TCGA和GTEx數據庫中BIRC5在包含LIHC在內的多種腫瘤的表達，發現BIRC5在包括肝細胞癌在內的多種腫瘤中顯著高表達(均P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

2.4 沉默BIRC5對Hep3B細胞增殖及凋亡的影響 見圖4。MTT實驗發現，與si-ctrl組相比，si-BIRC5組細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。細胞凋亡實驗發現，si-BIRC5組細胞凋亡比例顯著高于si-ctrl組(P<0.05)，表明沉默BIRC5可促進Hep3B細胞凋亡。

注：與si-ctrl組比較，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

3 討 論

目前手術是肝癌根治性治療的主要手段。肝癌早期癥狀不明顯，晚期肝癌患者伴有明顯疼痛感，嚴重影響患者的生活質量[12]，故多數患者確診時已處于中晚期，基本喪失手術治療的機會。盡管仍有多種治療方式如放療、化療、局部消融治療等可供選擇，但現有治療方法療效有限，復發率高，易發生遠處轉移，預后較差。近年來，分子靶向治療已成為研究的熱點，引起人們的廣泛關注，靶向藥物索拉卡菲尼、瑞格非尼、侖伐替尼等已進入臨床應用。靶向藥物與化療藥物聯合使用可能會改善患者預后。有研究[13]發現索拉非尼聯合聯合卡培他濱與單獨使用索拉菲尼相比可改善肝細胞癌患者預后。尋找合適的分子靶標對肝癌靶向治療有重要意義。

我們通過應用LinkedOmics網站分析miR-195與BIRC5在肝細胞癌中表達的相關性，發現兩者呈顯著負相關，雙熒光素酶報告基因實驗檢測二者靶向關系，結果表明miR-195可靶向作用BIRC5。BIRC5(Survivin)是一種控制細胞分裂、抑制細胞凋亡的蛋白質[14]。它是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員之一，該家族成員結構較相似，都具有桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列(BIR)結構域，該結構可能是半胱天冬酶(Caspase)的結合區域，為IAP 發揮抑制凋亡作用所必需[15]。BIRC5(Survivin)位于17號染色體長臂上，存在一個不含TATA盒的啟動子，啟動子含有3個細胞周期依賴性元件(CDE)和1個細胞周期同源結構域(CHR)[16]。BIRC5在成人終末分化組織中一般不表達或呈低表達，但在包括乳腺癌、肺癌、宮頸癌等多種腫瘤中廣泛表達[17-19]。BIRC5能夠抑制Caspase-3活性，從而調控細胞凋亡[20]。BIRC5在腫瘤中高度表達，在細胞分裂和細胞凋亡抑制過程中同時發揮作用，與腫瘤分級、預后不良等相關[21]。已有研究[22]表明BIRC5高表達與肝癌預后不良相關。腫瘤是一類異質性疾病，與細胞異常增殖及細胞死亡調控異常密切相關。參與細胞凋亡調控的分子被認為是腫瘤治療的潛在靶標，而BIRC5作為IAP家族成員，在細胞周期進程和凋亡抑制中發揮重要作用，其作為腫瘤治療的靶標引起人們的廣泛關注。

基于TCGA及GTEx數據庫，我們通過SangerBox數據分析平臺分析BIRC5在包括肝癌在內的27種腫瘤的表達水平，發現BIRC5在包括肝癌在內的多種腫瘤中呈高表達，提示BIRC5可能在腫瘤中發揮重要的癌基因作用。我們應用RNA干擾技術沉默BIRC5的表達后發現，沉默其表達可抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡，提示BIRC5在肝癌發生、發展過程中發揮癌基因的作用。

綜上所述，miR-195可通過靶向調控BIRC5抑制肝癌Hep3B細胞增殖，促進其凋亡。BIRC5可作為肝細胞癌靶向治療的新靶標。在后續研究中，我們將通過挽救實驗、Western blot實驗、體內實驗等進一步探索miR-195/BIRC5軸在肝癌進展中的作用。