HPLC 法同時測定喉痛靈顆粒中綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸、蒙花苷含量

古炳明，黃惠琳

1 梅州市食品藥品監督檢驗所，廣東 梅州 514011；2 嘉應學院醫學院，廣東 梅州 514011

喉痛靈顆粒由野菊花、板藍根、荊芥穗和水牛角濃縮粉組成，有清熱解毒、消炎利咽等功效，常用于治療慢性咽喉炎、急性化膿性扁桃體炎、感冒咽喉發熱、上呼吸道炎、疔瘡等。目前該藥的執行標準收載于《衛生部藥品標準中藥成方制劑》第五冊，僅有性狀與三個理化鑒別，無含量測定項目［1］。曾小平等曾以薄層色譜法對板藍根和荊芥穗進行定性鑒別，用高效液相色譜法測定野菊花中蒙花苷的含量［2］。胡恩建立高效液相色譜法測定喉痛靈顆粒中腺苷的含量［3］，但上述研究均為單指標含量分析，單一指標難以真實反映中藥的質量情況。野菊花、荊芥穗為方中投料量較大的藥物，野菊花中含有綠原酸、蒙花苷、木犀草苷等活性成分，荊芥穗中則含迷迭香酸、木犀草苷等成分［4-6］。研究證實綠原酸、蒙花苷、木犀草苷、迷迭香酸均有一定的抗炎、抗氧化等作用［7-10］，對上述指標進行含量測定以反映方中野菊花及荊芥穗的投料情況；因此本研究旨在通過建立HPLC 法同時測定綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸及蒙花苷四種活性成分的含量，以期加強對喉痛靈顆粒的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB204-N 型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Sartorius BP 211D 十萬分之一電子分析天平（賽托利斯公司）；LC-20AT 型液相色譜儀（日本島津公司）；ULUP-I-10T 型純水/超純水機（西安優普儀器設備有限公司）；KQ-250DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品綠原酸（批號：110753-201817，含量以96.8%計）；木犀草苷（批號：111720-201810，含量以93.5%計）；迷迭香酸（批號：111871-201706，含量以90.5%計）；蒙花苷（批號：111528-201710，含量以96.6%計）；均由中國食品藥品檢定研究院提供。喉痛靈顆粒：廣西A 公司（批號：181001、190302、190204、190504），廣州B 公司（批號：8341A04），河北C 公司（批號：04A181103）。色譜級甲醇（天津市四友精細化學品有限公司，批號：633379-05653），磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20180520）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，7%～45% A；30～45 min，45%～80% A；45～55 min，7% A）；檢測波長：334 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2 對照品儲備液的制備

分別精密稱取綠原酸對照品6.45 mg，木犀草苷對照品11.53 mg，迷迭香酸對照品11.44 mg，蒙花苷對照品4.96 mg，置20 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 混合對照品溶液的制備

分別精密吸取對照品儲備液各1 mL，置同一10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取喉痛靈顆粒研細，取2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放至室溫，再次稱重，以甲醇補充減失質量，取續濾液，作為供試品溶液。

2.5 陰性樣品的制備

按喉痛靈顆粒處方，稱取缺野菊花和荊芥穗的藥材適量按其生產工藝，制成不含上述藥材的陰性樣品。按“2.4”項下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.6 專屬性試驗

分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定。結果：供試品色譜圖中綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷的色譜峰分離度良好，與對照品溶液色譜峰保留時間一致，理論塔板數均大于1×105，且陰性樣品無干擾，見圖1。

圖1 混合對照品（A）、喉痛靈顆粒供試品（B）、缺野菊花和荊芥穗陰性樣品（C）的HPLC圖

2.7 線性關系考察

取“2.3”項下混合對照品溶液，分別進樣1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項下的色譜條件測定，測出其峰面積。以對照品進樣質量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸分析，得回歸方程及線性范圍。結果見表1。

表1 4種成分的回歸方程和線性范圍（n=6）

2.8 精密度試驗

取混合對照品溶液，連續進樣6 針，記錄各自的峰面積，根據峰面積計算得綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷峰面積的RSD 值分別為0.29%、0.32%、0.31%、0.24%。

2.9 重復性試驗

取批號181001 喉痛靈顆粒樣品6 份，制備供試品溶液，分別進樣測定峰面積，計算得綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷含量的RSD 值分別為1.30%、1.14%、0.70%、0.98%。

2.10 穩定性試驗

取批號181001 喉痛靈顆粒樣品6 份，制備供試品溶液，在0、2、4、8、24 h 分別進樣，記錄各自的峰面積，計算得綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷峰面積RSD 值分別為1.00%、1.11%、1.01%、1.44%。

2.11 加樣回收試驗

取批號181001 喉痛靈顆粒樣品6 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入混合對照品溶液（含綠原酸156.09 μg/mL，木犀草苷269.51 μg/mL，迷迭香酸254.27 μg/mL，蒙花苷119.78 μg/mL）1.0 mL，按“2.4”項下制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷平均回收率分別為99.02%、100.12%、99.83%、98.95%，RSD 值分別為0.50%、0.32%、0.29%、1.34%，見表2。

表2 加樣回收結果

2.12 樣品測定

取6 批喉痛靈顆粒，分別制備供試品溶液，進樣測定，根據標準曲線法計算各成分的含量，結果見表3。由表中數據可知，不同廠家間、同一個廠家不同批次產品中綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷的含量差異較大。

表3 樣品測定結果

3 討論

3.1 洗脫條件的建立

本研究曾參照梁健麗等［11］采用HPLC 法同時測定野菊花配方顆粒中綠原酸、咖啡酸和蒙花苷的方法，發現待測物對于洗脫溶液的梯度變化較敏感，經多次微調后最終確定了“2.1”項下的洗脫方式，但流速為1.0 mL/min 時木犀草苷與雜質峰分離度不足1.5，后將流速降低至0.8 mL/min 后分離度在1.5以上且各目標峰的峰形良好。

3.2 檢測波長的選擇

取對照品溶液，在200～400 nm 范圍內進行DAD 全波長掃描分析，綠原酸在326 nm 處有最大吸收，木犀草苷在350 nm 處有最大吸收，迷迭香酸在329 nm 處有最大吸收，蒙花苷在334 nm 處有最大吸收，各目標物最大吸收波長相近且在334 nm處均有較大吸收，色譜峰尖銳且塔板數均在1×105以上，最終選定檢測波長為334 nm。

3.3 含量結果分析

本研究測定了3 個廠家的6 個批次的喉痛靈顆粒，由表3 可知，3 個廠家的6 個批次樣品均能測出綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸、蒙花苷，且含量存在一定的差異。通過對比由廣西A 公司生產的4個不同批次的喉痛靈顆粒，其中批號190204 中綠原酸、迷迭香酸、蒙花苷的含量較其他3 個批次的高，且蒙花苷的含量是批號190504 的近2 倍，說明喉痛靈顆粒不同廠家間、同一個廠家不同批次間綠原酸、迷迭香酸、蒙花苷含量差異較大，有必要通過制定標準以加強其質量控制。

4 結論

本研究建立的HPLC 同時測定喉痛靈顆粒中綠原酸、木犀草苷、迷迭香酸、蒙花苷含量的方法，各色譜峰可有效分離、重現性良好且方便快捷，可為進一步提升喉痛靈顆粒的質量評價方法提供參考依據。