基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)快速鑒定當(dāng)歸中苯酞類和有機(jī)酸類成分

張清清 馮媛 李春花 李國川 劉興超 李顥玥 王紅芳 周莉 張一昕

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）05-0579-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.12

摘 要 目的 建立全面、快速分析當(dāng)歸中苯酞類和有機(jī)酸類等化學(xué)成分的方法，為當(dāng)歸的質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥效物質(zhì)研究提供科學(xué)依據(jù)。方法 以當(dāng)歸70%乙醇提取液為分析樣品，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH-C18，流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液-乙腈溶液（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。離子源為電噴霧離子源，采用正離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為m/z 50～1 000;毛細(xì)管電壓為4 000 V;霧化器壓力為35 psi;裂解電壓為135 V，錐孔電壓為65 V;干燥氣溫度為320 ℃;干燥氣流量為10 L/min，鞘流氣流量為11 L/min;碰撞能量為20、40 V。使用Qualitative Analysis 10.0軟件獲取化合物的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)及二級(jí)碎片等信息，通過與對照品質(zhì)譜圖比對，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道、質(zhì)譜裂解規(guī)律及Chemspider、MassBank、PubChem等數(shù)據(jù)庫信息對化合物進(jìn)行分析。結(jié)果 從當(dāng)歸提取物中共鑒定或推斷出72個(gè)化合物，包括苯酞類化合物55個(gè)、有機(jī)酸類化合物13個(gè)、其他類化合物4個(gè)。結(jié)論 成功建立了能快速、準(zhǔn)確識(shí)別與鑒定當(dāng)歸中有機(jī)酸類和苯酞類等化學(xué)成分的方法，為其化學(xué)成分的全面表征提供了一種高效、快速的分析手段。

關(guān)鍵詞 當(dāng)歸;有機(jī)酸類;苯酞類;化學(xué)成分;超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

Rapid identification of phthalides and organic acids in Angelica sinensis based on UPLC-Q-TOF/MS

ZHANG Qingqing1，2，F(xiàn)ENG Yuan1，3，LI Chunhua1，LI Guochuan1，LIU Xingchao1，LI Haoyue1，WANG Hongfang1，ZHOU Li1，ZHANG Yixin1（1. College of Pharmacy， Hebei University of Chinese Medicine， Shijiazhuang 050200，China; 2. Hebei TCM Formula Preparation Technology Innovation Center，Shijiazhuang 050091， China; 3. Hebei Traditional Chinese Medicine Processing Technology Innovation Center， Shijiazhuang 050091， China）

ABSTRACT OBJECTIVE To establish a comprehensive and rapid method for the analysis of chemical constituents as phthalides and organic acids in Angelica sinensis，and to provide scientific reference for the quality evaluation and pharmacodynamic substance research of A. sinensis. METHODS The 70% ethanol extract of A. sinensis was analyzed by ultra high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight tandem mass spectrometry （UPLC-Q-TOF/MS）. The determination was performed on ACQUITY UPLC BEH-C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 2 μL. The ion source was an electrospray ion source， using positive ion scanning mode， and the mass scanning range was m/z 50-1 000. Capillary voltage was 4 000 V; atomizer pressure was 35 psi; cracking voltage was 135 V and the taper hole voltage was 65 V; the temperature of dry gas was 320 ℃; the flow of dry gas was 10 L/min and the flow of sheath gas was 11 L/min; collision energy were 20 and 40 V. Qualitative Analysis 10.0 software was used to obtain the retention time of compounds， the accurate mass number of excimer ion peaks and secondary fragments. The compounds were analyzed by comparing with the mass spectra of the reference substance， combined with relevant literature， mass spectrometry cleavage law and database such as Chemspider， MassBank， PubChem. RESULTS A total of 72 compounds were identified or deduced from A. sinensis， including 55 phthalides， 13 organic acids and 4 other constituents. CONCLUSIONS The established method is rapid and accurate for the identification of chemical constituents from A. sinensis， such as organic acids and phthalides， which provides an efficient and rapid analytical method for the comprehensive characterization of its chemical constituents.

KEYWORDS Angelica sinensis; organic acids; phthalides; chemical constituents; UPLC-Q-TOF/MS

隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)在中藥成分分析中的應(yīng)用越來越多，該技術(shù)可提供化合物準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)及豐富的碎片信息，能更可靠地表征未知化合物的結(jié)構(gòu)。因此，該技術(shù)常常作為中藥成分定性或相對定量分析的首選技術(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對中藥化學(xué)成分的快速識(shí)別和鑒定[1]。前期，本課題組分別采用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇和乙醇作為提取溶劑，以色譜峰的數(shù)量、響應(yīng)值和峰形為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對當(dāng)歸的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定以70%乙醇為溶劑進(jìn)行供試品溶液的制備。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對當(dāng)歸70%乙醇提取液中的苯酞類等化合物進(jìn)行研究，并結(jié)合文獻(xiàn)和有關(guān)資料，通過對苯酞類和有機(jī)酸類等化合物的分析和總結(jié)，為這些化合物的定性分析提供一種快速、有效的方法，同時(shí)也為當(dāng)歸藥材的質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

1290 Infinity型UPLC儀、6545型四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀均購自美國Agilent公司;BSA224S-CW型電子分析天平購自德國Sartorius公司;KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司;Eppendorf Centrifuge 5418型離心機(jī)購自德國Eppendorf AG公司;Synergy UV型超純水制備系統(tǒng)購自美國Millipore公司。

1.2 主要藥品與試劑

當(dāng)歸飲片購自國藥樂仁堂河北藥業(yè)有限公司（批號(hào)20041701，產(chǎn)地為甘肅），經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院張丹教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸A. sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。Z-藁本內(nèi)酯對照品（批號(hào)MUST-18051010，純度99.55%）購自成都曼思特生物科技有限公司;正丁基苯酞對照品（批號(hào)6066-49-5，純度98%）、洋川芎內(nèi)酯H對照品（批號(hào)94596-27-7，純度98%）、洋川芎內(nèi)酯I對照品（批號(hào)94596-28-8，純度98%）均購自上海源葉生物科技有限公司;洋川芎內(nèi)酯A對照品（批號(hào)63038-10-6，純度98%）、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對照品（批號(hào)88182-33-6，純度98%）均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;甲酸、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，0%B→50%B;10～16 min，50%B→60%B;16～20 min，60%B→85%B;20～22 min，85%B;22～25 min，85%B→95%B;25～26 min，95%B→100%B;26～36 min，100%B）;柱溫為30 ℃;流速為0.3 mL/min;進(jìn)樣量為2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI），采用正離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為m/z 50～1 000;毛細(xì)管電壓為4 000 V;霧化器壓力為35 psi;裂解電壓為135 V，錐孔電壓為65 V;干燥氣溫度為320 ℃;干燥氣流量為10 L/min，鞘流氣流量為11 L/min;碰撞能量為20、40 V。

2.3 供試品溶液的制備

取當(dāng)歸飲片適量，粉碎，過40目篩。精密稱取粉末2.0 g，加入20 mL 70%乙醇溶液，超聲（功率360 W，頻率40 kHz）提取30 min，以10 000 r/min離心5 min，吸取2 mL上清液于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，即得。

2.4 混合對照品溶液的制備

精密稱取洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、正丁基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、Z-藁本內(nèi)酯和歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對照品各1 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，得各單一對照品母液。分別取上述單一對照品母液0.5 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，制成各成分質(zhì)量濃度均為0.005 mg/mL的混合對照品溶液，混勻后備用。

2.5 當(dāng)歸化學(xué)成分分析

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液和“2.4”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，分別按“2.1”“2.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，利用Qualitative Analysis 10.0軟件獲取化合物的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)及二級(jí)碎片等信息，通過與對照品質(zhì)譜圖比對，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道、質(zhì)譜裂解規(guī)律及Chemspider、MassBank、PubChem等數(shù)據(jù)庫信息對化合物進(jìn)行分析。結(jié)果，從當(dāng)歸中鑒定或推斷出72個(gè)化合物，包括55個(gè)苯酞類化合物、13個(gè)有機(jī)酸類化合物、4個(gè)其他類化合物?；旌蠈φ掌啡芤旱目傠x子流圖見圖1，當(dāng)歸化學(xué)成分的總離子流圖見圖2，當(dāng)歸化學(xué)成分的鑒定結(jié)果及數(shù)據(jù)見表1。

2.6 幾類主要化合物的裂解特征分析

2.6.1 有機(jī)酸類化合物 有機(jī)酸類化合物是一種廣泛存在于自然界植物中的酸性有機(jī)化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化和抗菌、消炎等藥理作用，其在質(zhì)譜中容易丟失CO、CO2、-COOH、H2O等而產(chǎn)生碎片離子峰[11]。本研究共鑒定出13種有機(jī)酸類化合物，包括精氨酸、纈氨酸、阿魏酸和異阿魏酸等。

本研究以化合物14為例進(jìn)行裂解規(guī)律分析。該化合物的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為195.065 3，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，判斷該化合物的分子式為C10H10O4。其二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子包括m/z 177.054 4、149.059 7、137.059 2。其中，碎片離子m/z 177.054 4、m/z 149.059 7分別為準(zhǔn)分子離子峰丟失1分子H2O、HCOOH產(chǎn)生，m/z 137.059 2為準(zhǔn)分子離子峰同時(shí)丟失1個(gè)CH2自由基和1分子CO2產(chǎn)生。根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]，推斷該化合物為阿魏酸，其可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

2.6.2 苯酞類化合物 苯酞類化合物包括簡單苯酞（即苯酞單體）和苯酞二聚體兩大類，是當(dāng)歸的主要有效成分[12]。苯酞單體類化合物在質(zhì)譜裂解中容易丟失H2O、CO、烷基自由基（CH3、C2H4、C3H6、C4H8等）及CO2等產(chǎn)生特征碎片;苯酞二聚體類化合物會(huì)先裂解為苯酞單體，常產(chǎn)生m/z 191的特征離子，在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生與上述單體相同的特征裂解碎片。簡單苯酞類化合物是以一個(gè)苯酞類結(jié)構(gòu)單元為母核，沒有含氧取代的一類成分，主要有Z-藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞等;苯酞二聚體類化合物是一類由2個(gè)苯酞單體聚合物形成的化合物，主要有當(dāng)歸雙藁本內(nèi)酯A、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A等。苯酞類化合物在二級(jí)質(zhì)譜中易丟失H2O、CO、C2H4、C3H6、C4H8等分子而產(chǎn)生碎片離子[13]。本研究共鑒定或推斷出苯酞類化合物55個(gè)，并對代表性苯酞類化合物（化合物56、化合物57和化合物69）的裂解途徑進(jìn)行舉例分析。

化合物56：準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+ 193.122 5，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，判斷該化合物的分子式為C12H16O2。其二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子包括m/z 175.111 5、147.116 8、137.059 7。其中，碎片離子m/z 175.111 5為準(zhǔn)分子離子峰丟失1分子H2O產(chǎn)生，在此基礎(chǔ)上再丟失1分子CO產(chǎn)生m/z 147.116 8的特征碎片;m/z 137.059 7為準(zhǔn)分子離子峰丟失1個(gè)C4H8自由基后產(chǎn)生。結(jié)合參考文獻(xiàn)[6]，并與對照品圖譜比對，鑒定該化合物為洋川芎內(nèi)酯A?；衔?6可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖4，洋川芎內(nèi)酯A對照品的質(zhì)譜圖見圖5。

化合物57：準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+ 191.106 6，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，判斷該化合物的分子式為C12H14O2。其二級(jí)質(zhì)譜的主要碎片離子包括m/z 173.095 9、163.105 7、145.101 2等。碎片離子m/z 173.095 9為準(zhǔn)分子離子峰丟失1分子H2O產(chǎn)生;m/z 163.105 7為準(zhǔn)分子離子峰丟失1分子CO產(chǎn)生，并在此基礎(chǔ)上繼續(xù)丟失1分子H2O產(chǎn)生m/z 145.101 2的碎片離子。結(jié)合參考文獻(xiàn)[6]，并與對照品圖譜比對，鑒定該化合物為Z-藁本內(nèi)酯?；衔?7可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖6，Z-藁本內(nèi)酯對照品的質(zhì)譜圖見圖7。

化合物69：準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+ 381.207 1，根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，判斷該化合物的分子式為C24H28O4。其二級(jí)質(zhì)譜的主要碎片離子包括m/z 191.106 5、173.095 9、149.022 6、135.115 8。其中，碎片離子m/z 191.106 5是苯酞二聚體裂解為苯酞單體后產(chǎn)生;碎片離子m/z 173.095 9是裂解后的單體丟失1分子H2O產(chǎn)生，碎片離子m/z 149.022 6、135.115 8為裂解后的單體分別丟失1個(gè)C3H6或C4H8自由基后產(chǎn)生。結(jié)合參考文獻(xiàn)[9]，并與對照品圖譜比對，鑒定該化合物為歐當(dāng)歸內(nèi)酯A。化合物69可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖8，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對照品的質(zhì)譜圖見圖9。

3 討論

UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)可快速、全面地對中藥化學(xué)成分進(jìn)行定性研究，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于中藥或復(fù)雜未知物的鑒定分析。為了更快速、可靠地鑒定中藥當(dāng)歸中的化學(xué)成分，本課題組選用該技術(shù)對當(dāng)歸提取物進(jìn)行分析。在制備當(dāng)歸供試品時(shí)，筆者分別采用了30%、50%、70%、90%甲醇和70%乙醇作為提取溶劑，以色譜峰的響應(yīng)值、峰形、峰個(gè)數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終選取70%乙醇為提取溶劑進(jìn)行樣品提取。

本研究根據(jù)化合物準(zhǔn)分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、分子式并結(jié)合對照品圖譜比較、質(zhì)譜裂解規(guī)律分析及數(shù)據(jù)庫信息比對等方式從當(dāng)歸中鑒定或推斷出72個(gè)化合物，包括苯酞類化合物55個(gè)、有機(jī)酸類化合物13個(gè)、其他類化合物4個(gè)。苯酞類成分作為當(dāng)歸揮發(fā)油的重要組成部分，也是當(dāng)歸的重要藥效成分，具有平喘、抗腫瘤、抗血小板聚集等作用[14-15]。如Z-藁本內(nèi)酯可抑制HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，對L1210和K562腫瘤細(xì)胞的增殖也有顯著的抑制作用[16]。有機(jī)酸類化學(xué)成分具有清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化等活性[17]，如阿魏酸能減輕超氧自由基和過氧化氫引起的膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少丙二醛的生成，能明顯降低羥自由基及丙二醛的溶血作用[18]。

本研究成功建立了快速鑒定當(dāng)歸中有機(jī)酸類和苯酞類等化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF/MS法，為當(dāng)歸化學(xué)成分的全面表征提供了一種高效、快速的分析手段，也為該藥的質(zhì)量控制研究、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡釋及資源的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。此外，本研究中所有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)均為正離子模式下采集，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的局限性，還需對其進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)展和更深層次的研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 宋禎彥，何攀，李富周，等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定當(dāng)歸芍藥散提取物和含藥血清中3種活性成分含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2021，28（1）：92-99.

[ 2 ] 陳方超，高守紅，王志鵬，等.基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)鑒定藤梨根的化學(xué)成分[J].中國藥房，2020，31（14）：1725-1731.

[ 3 ] 牛研，王書芳. LC-Q-TOF-MS和LC-IT-MSn分析當(dāng)歸芍藥散中化學(xué)成分[J].中草藥，2014，45（8）：1056-1062.

[ 4 ] 劉騰，許晉芳，盧曉林，等.基于LC-MS代謝組學(xué)研究黃芪注射液對白細(xì)胞減少癥模型小鼠的干預(yù)作用[J].中國藥房，2020，31（21）：2627-2633.

[ 5 ] 李蓉蓉，游蓉麗，秦雪梅，等.基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)快速識(shí)別芪蛭通絡(luò)膠囊化學(xué)成分[J].中國中藥雜志，2020，45（20）：4918-4928.

[ 6 ] 張紀(jì)紅，吳衛(wèi)東，劉建庭，等.基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)活血止痛膠囊化學(xué)成分的快速分析[J].中草藥，2020，51（12）：3139-3146.

[ 7 ] SHAW L H，CHEN W M，TSAI T H. Identification of multiple ingredients for a traditional Chinese medicine preparation （bu-Yang-Huan-wu-Tang） by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry[J]. Molecules，2013，18（9）：11281-11298.

[ 8 ] WEI W L，HUANG L F. Simultaneous determination of ferulic acid and phthalides of Angelica sinensis based on UPLC-Q-TOF/MS[J]. Molecules，2015，20（3）：4681- 4694.

[ 9 ] 王希梅，趙澤軍，張，等.當(dāng)歸不同提取方法提取物中揮發(fā)性成分比較研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2018，37（1）：61-65.

[10] 李寧.基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)的參桂膠囊中主要化學(xué)成分研究[J].中草藥，2019，50（3）：573-581.

[11] 張清清，馮媛，楊貴雅，等.基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的當(dāng)歸提取物化學(xué)成分研究[J].廣東化工，2021，48（5）：175-178.

[12] 趙靜，夏曉培.當(dāng)歸的化學(xué)成分及藥理作用研究現(xiàn)狀[J].臨床合理用藥雜志，2020，13（6）：172-174.

[13] 黃雯雯.川芎和少花蒺藜草中活性物質(zhì)的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定[D].北京：北京化工大學(xué)，2013.

[14] GONG W X，ZHU S W，CHEN C C，et al. The anti-depression effect of Angelicae sinensis Radix is related to the pharmacological activity of modulating the hematolo- gical anomalies[J]. Front Pharmacol，2019，10：192.

[15] 孫敏，馬清林，劉峰林，等.當(dāng)歸揮發(fā)油研究新進(jìn)展[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2019，19（16）：56-58.

[16] 張來賓，呂潔麗，陳紅麗，等.當(dāng)歸中苯酞類成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2016，41（2）：167-176.

[17] 陳琳，朱靖，王嵩，等.當(dāng)歸主要活性成分提取方法及其活性研究進(jìn)展[J].上海醫(yī)藥，2021，42（9）：71-75.

[18] 黃紅泓，覃日宏，柳賢福.中藥當(dāng)歸的化學(xué)成分分析與藥理作用探究[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2019，19（58）：127，153.

（收稿日期：2021-11-30 修回日期：2022-01-11）

（編輯：林 靜）

1407501705275