莪術醇抗T47D乳腺癌細胞增殖的作用機制研究

周璐煒 王娟 陳旭

中圖分類號 R73-3;R96 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）05-0548-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.07

摘 要 目的 研究莪術醇抗T47D乳腺癌細胞增殖的作用機制。方法 采用MTT法檢測不同劑量莪術醇（0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）對T47D乳腺癌細胞增殖的抑制作用。以莪術醇（12.5、25、50、100 μg/mL）干預T47D乳腺癌細胞后，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態;采用流式細胞儀檢測細胞周期及活性氧（ROS）水平;采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）、細胞周期調控因子p21和細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）的mRNA表達水平;采用Western blot法檢測CDK2、CDK6、細胞周期蛋白D（Cyclin D）、PCNA、核轉錄因子E2-相關因子（Nrf2）、Kelch樣ECH關聯蛋白1（Keap1）的蛋白表達水平。另將細胞分為2組，其中一組加入不同劑量莪術醇，另外一組加入33 μg/mL莪術醇干預6、12、24、48 h，根據以上2組結果確定最佳氧化時間和給藥濃度后，另設空白對照組、N-乙酰半胱氨酸（NAC）組（單用ROS抗氧化劑NAC）、莪術醇組（單用莪術醇）、莪術醇聯合NAC組（采用ROS抗氧化劑NAC預處理，再加入莪術醇），檢測細胞周期及ROS熒光強度。結果 莪術醇能使T47D乳腺癌細胞增殖抑制率顯著升高（P<0.05或P<0.01），并呈一定的劑量和時間依賴趨勢。莪術醇能將T47D乳腺癌細胞周期阻滯于G1期，并使ROS水平顯著增加（P<0.05或P<0.01）;ROS抗氧化劑NAC能夠逆轉莪術醇的上述誘導作用（P<0.01）。qRT-PCR結果顯示，莪術醇能下調PCNA和CDK2 mRNA的表達，并上調p21 mRNA的表達（P<0.05或P<0.01）。Western blot結果顯示，莪術醇能顯著下調Keap1、Nrf2、CDK2、CDK6和Cyclin D的蛋白表達（P<0.05或P<0.01）;ROS抗氧化劑NAC能夠逆轉莪術醇對上述蛋白表達的下調作用（P<0.05或P<0.01）。結論 莪術醇可能通過誘導氧化應激和細胞周期阻滯，發揮抑制T47D乳腺癌細胞增殖的作用。

關鍵詞 莪術醇;T47D乳腺癌細胞;細胞周期阻滯;細胞增殖;氧化應激;作用機制

Study on the mechanism of curcumol inhibiting the proliferation of breast cancer cells T47D

ZHOU Luwei1，WANG Juan1，2，CHEN Xu1（1. Key Laboratory of Pharmacognosy， College of Pharmacy， Guilin Medical University， Guangxi Guilin 541100， China; 2. School of Basic Medicine， Guilin Medical University， Guangxi Guilin 541100， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the mechanism of curcumol inhibiting the proliferation of breast cancer cells T47D. METHODS MTT assay was used to detect the inhibitory effects of different doses of curcumol（0， 6.25， 12.5， 25， 50， 100? ? ? ? ?μg/mL）on the proliferation of T47D cells. After treated with curcumol （12.5， 25， 50， 100 μg/mL）， the morphology of T47D cells was observed by inverted phase contrast microscope. The cell cycle and the levels of reactive oxygen species （ROS） were detected by flow cytometry. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to detect the expressions of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， cell cycle regular p21 and cyclin-dependent kinase 2 （CDK2） mRNA. Western blot assay was used to detect the protein expression of CDK2， CDK6， Cyclin D， PCNA， nucler transcription factor E2-related factor （Nrf2） and Kelch-like ECH associated protein 1 （Keap1）. Breast cancer cells T47D were divided into 2 groups， one group was given different doses of curcumol， and another group was given curcumol 33 μg/mL for 6， 12， 24， 48 h. After the optimal oxidation time and administration concentration were determined according to the results of the above two groups， the blank control group， N-acetylcysteine （NAC） group （ROS antioxidant NAC alone）， curcumol group （curcumol alone）， curcumol combined with NAC group （pretreatment with ROS antioxidant NAC， and then adding into curcumol）. Cell cycle and fluorescence intensity of ROS were detected. RESULTS Curcumol could significantly increase the inhibitory rate of the proliferation of T47D cells （P<0.05 or P<0.01）， and showed a certain dose and time dependent trend. Curcumol blocked the cycle in the G1 phase and significantly increased the level of ROS （P<0.05 or P<0.01）; ROS antioxidant NAC could significantly reverse above inductive effect of curcumol （P<0.01）. qRT-PCR showed that curcumol down-regulated the expression of PCNA and CDK2 mRNA and up-regulated the expression of p21 mRNA （P<0.05 or P<0.01）. Western blot assay showed that curcumol significantly down-regulated the protein expression of Keap1， Nrf2， CDK2， CDK6 and Cyclin D （P<0.05， P<0.01）; ROS antioxidant NAC could reverse the down-regulation effects of curcumol on the expression of these proteins （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS Curcumol may induce oxidative stress and cell arrest in G1 phase to inhibit the proliferation of T47D cells.

KEYWORDS? ?curcumol; breast cancer cells T47D; cell cycle arrest; cell proliferation; oxidative stress; mechanism

乳腺癌是最常見的惡性婦科腫瘤，且患病呈年輕化趨勢，嚴重影響女性健康[1-2]。乳腺組織形成惡性細胞是乳腺癌的特征，遺傳基因突變、藥物使用、飲食習慣及環境因素均可誘發或加劇乳腺癌[1]。乳腺癌分子分型包括luminal A型、luminal B型、Her-2陽性、基底細胞樣4種亞型，主要采取化療、放療、內分泌治療及靶向治療等策略，其中化療和靶向治療是晚期乳腺癌的主要治療方法，但藥物產生的不良反應和耐藥性嚴重影響治療效果和患者的生存質量[1]。中藥因其低毒性、多靶點的特性，被廣泛用作抗腫瘤增敏劑及耐藥逆轉劑[3-4]。很多從天然植物中分離得到的提取物具有明顯抑制腫瘤細胞增殖的作用，為臨床防治腫瘤提供了新的選擇，也為天然產物開發及道地藥材現代化提供了新的思路[5]。

莪術Curcuma zedoaria Rosc.是常用的中藥，具有行氣解郁、破瘀、止痛的功效，常用于治療血氣心痛、食積脹痛、瘀血經閉[6]。莪術醇是從莪術揮發油中提取的倍半萜類化合物，具有良好的抗腫瘤活性。筆者團隊前期研究表明，莪術醇對肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤細胞均有良好的抑制效果[7-10]，但其抗乳腺癌機制尚未闡明。因此，本研究以人T47D乳腺癌細胞為研究對象，探討莪術醇影響T47D乳腺癌細胞增殖的作用機制，為莪術醇的臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料

1.1 儀器

Infinite M200 PRO型酶標儀購自瑞士Tecan公司;CKX 31型倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司;ClassⅡ BSC型生物安全柜購自新加坡Esco科技有限公司;AccuriTM C6 Plus型流式細胞儀購自美國BD公司;CFX Manager 3.0軟件、Power PacTM Basic型蛋白電泳系統、Western blot系統、Chemi DocTM XRS+化學發光凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司;Biofuge Stratos型低溫高速離心機購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 藥物與試劑

莪術醇（純度>99%，批號C100409）購自貴州迪大科技有限責任公司;無水乙醇（貨號64-17-5）購自成都市科隆化工試劑廠;DMEM高糖培養基（批號8115027）購自美國Gibco公司;小牛血清（貨號FB15015）購自美國Clark Cooper公司;青鏈霉素混合液（貨號P1400）、制膠劑（貨號A1010）、胰蛋白酶（批號510T0414）和磷酸鹽緩沖液（PBS，批號20200604）購自北京索萊寶科技有限公司;乙二胺四乙酸二鈉（貨號6381-92-6）、異丙醇（批號1912191）購自汕頭市西隴化工股份有限公司;MTT試劑（貨號298-93-1）購自美國Amresco公司;二甲基亞砜（批號50116）購自天津百倫斯生物技術有限公司;實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）引物[包括細胞周期調控因子p21（貨號HS150827022）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA，貨號HS150827022）、細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2，貨號HS151104006）、β-肌動蛋白（β-actin，貨號HXP08271730609）]購自美國Invitrogen公司;BCA蛋白定量檢測試劑盒（批號080919191105）、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC，批號111015160224）購自上海碧云天生物科技有限公司;ECL發光試劑盒（批號1824c03）購自美國Affinity公司;吐溫20（批號 20200820）購自天津市致遠化學試劑有限公司;核轉錄因子E2-相關因子（nucler transcription factor E2-related factor，Nrf2，批號333778）、Kelch樣ECH關聯蛋白1（Kelch-like ECH associated protein 1，Keap1，批號333865）購自艾比瑪特生物醫藥（上海）有限公司;細胞周期抗體CDK6、CDK2、細胞周期蛋白D（Cyclin D）（批號GR3317473-1）購自英國Abcam公司;β-actin抗體（批號17AVO412）購自北京中杉金橋生物技術有限公司;PCNA抗體（批號AF0239）購自美國Affinity公司;核糖核酸酶A（RNase A，貨號ZS103-L）購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒（批號9057689）購自美國BD公司;DCFH-DA探針（貨號38483-26-0）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司;Trizol試劑（批號W9208）購自北京天根生化科技有限公司;三氯甲烷（貨號67-66-3）購自成都市科隆化學有限公司;丙烯酰胺（批號691259610）購自合肥白鯊生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG二抗（批號EM35110-01）購自北京依瑪博科技有限公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（貨號A27036）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 細胞株

本研究所用人T47D乳腺癌細胞株購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 方法

2.1 細胞培養與傳代

T47D乳腺癌細胞培養于37 ℃、5%CO2飽和濕度的DMEM高糖培養基（含10%小牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 g/L）中。在細胞融合度為80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶和0.5 mmol/L乙二胺四乙酸的混合液消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2 細胞增殖抑制率的檢測

采用MTT法檢測。T47D乳腺癌細胞消化傳代后，接種于96孔板中，使每個孔中細胞量為5×103個，每孔體積為100 μL。待細胞貼壁后加入不同劑量的莪術醇[終質量濃度分別為0（空白對照）、6.25、12.5、25、50、100、150 μg/mL，劑量參照文獻[8]設定]，每個劑量設置3個復孔。于給藥24、48、72 h后加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，間隔4 h后加入150 μL二甲基亞砜，待甲瓚晶體溶解后使用酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度（A）值，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1- A給藥組/A空白對照組）×100%。

2.3 細胞形態的觀察

將對數生長期的T47D乳腺癌細胞接種于6孔板，加入不同劑量的莪術醇[終質量濃度分別為0（空白對照）、12.5、25、50、100 μg/mL，劑量參照文獻[9]設定]，每個劑量設置3個復孔。給藥48 h后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

2.4 細胞周期的檢測

采用流式細胞儀檢測。將T47D乳腺癌細胞接種于70 mm培養皿中，調整細胞密度為5×105個/皿，待細胞貼壁后加入不同劑量的莪術醇（終質量濃度同“2.3”項下）。給藥48 h后用75%冰乙醇固定細胞，混勻后-20 ℃保存;隔天離心棄上清液，以冰PBS洗滌2次，加入500 μL的RNase A（100 mg/mL），37 ℃水浴30 min;加入25 μL PI避光室溫染色30 min，300目篩網過濾，上機分析細胞周期分布。利用Flow Jo軟件分析G1、S、G2期細胞占比。

2.5 細胞周期相關基因mRNA表達水平的檢測

采用qRT-PCR法檢測。將T47D乳腺癌細胞接種于培養皿中，調整細胞密度為1×106個/皿，待細胞貼壁后加入不同劑量的莪術醇（終質量濃度同“2.3”項下）。給藥48 h后收集細胞，依次加入Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、乙醇提取總RNA，檢測RNA純度及濃度后，按照試劑盒說明書進行qRT-PCR反應，PCR引物序列及產物長度見表1。采用Bio-Rad CFX Manager 3.0上機，以2-ΔΔCt表示細胞周期相關基因的mRNA表達水平。

2.6 細胞周期相關蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法檢測。將T47D乳腺癌細胞接種于培養皿中，調整細胞密度為1×106個/皿，待細胞貼壁后加入不同劑量的莪術醇（終質量濃度同“2.3”項下）。收集給藥48 h后的細胞，加入300 μL RIPA裂解液，4 ℃冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心20 min取上清液。蛋白經定量、煮沸處理后，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜，加入對應的CDK2、Cyclin D、PCNA、CDK6、β-actin抗體（稀釋度分別為? ? 1 ∶ 2 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 8 000），4 ℃冰箱過夜;次日用PBST（PBS+吐溫20）洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG作為二抗（稀釋度分別為1 ∶ 4 000、1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h;用PBST（PBS+吐溫20）洗膜3次后，加入ECL顯色劑，使用化學發光凝膠成像系統檢測目的蛋白。利用Image J軟件分析，以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值表示上述細胞周期相關蛋白的表達水平。

2.7 細胞中ROS的檢測

當T47D乳腺癌細胞培養皿中的細胞生長到融合度為80%～90%時，重懸并接種細胞至6孔板中，使每個孔中細胞量為4×105個，待其貼壁后分為2組：其中一組加入不同劑量莪術醇[終質量濃度同“2.3”項下，另依據MTT結果添加半數抑制濃度（IC50）為33 μg/mL的劑量組];另外一組加入33 μg/mL莪術醇干預6、12、24、48 h。將兩組細胞收集至15 mL離心管中，PBS洗滌3次后，用500 μL PBS懸浮細胞，每個樣品加入ROS探針DCFH-DA，避光室溫染色30 min;染色完畢，PBS洗滌3次，500 μL PBS重懸細胞，300目篩網過濾后上機檢測ROS水平。根據結果確定最佳氧化時間為24 h、最佳給藥濃度為33 μg/mL。

另取細胞分為空白對照組、NAC組（單用1 μmol/L的ROS抗氧化劑NAC）、莪術醇組（單用33 μg/mL的莪術醇）、莪術醇聯合NAC組（采用1 μmol/L的ROS抗氧化劑NAC預處理細胞30 min，再加入33 μg/mL的莪術醇），給藥48 h后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態并拍照，每個濃度設置3個復孔。采用流式細胞儀檢測其ROS表達水平及周期分布。利用Flow Jo軟件分析G1、S、G2期細胞占比，DCFH-DA探針檢測ROS的熒光強度（結果解析：平均熒光強度值越大，細胞中產生的ROS越多），同“2.6”項下方法檢測ROS相關蛋白Nrf2和Keap1（抗體稀釋度分別為1 ∶ 2 000、1 ∶ 4 000）的表達水平。

2.8 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;不同時間點的比較采用重復測量方差分析。采用Graphpad Prism 8.0作圖工具作圖。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 莪術醇對T47D乳腺癌細胞增殖的影響

莪術醇能使T47D乳腺癌細胞增殖抑制率顯著升高（P<0.05或P<0.01），并呈一定的劑量和時間依賴趨勢，其中150 μg/mL莪術醇處理72 h后細胞增殖抑制率在80%左右。結果見表2。

3.2 莪術醇對T47D乳腺癌細胞形態的影響

倒置相差顯微鏡下可見，空白對照組T47D乳腺癌細胞形態正常;給予12.5、25、50、100 μg/mL莪術醇干預48 h后，細胞逐漸皺縮，類圓球形細胞增多，正常形態細胞減少。結果見圖1。

3.3 莪術醇對T47D乳腺癌細胞周期的影響

流式細胞檢測結果顯示，與空白對照組比較，莪術醇25～100 μg/mL組干預T47D乳腺癌細胞48 h后，G1期細胞占比顯著升高（P<0.01）;且隨著莪術醇給藥劑量的增加，G1期細胞占比呈遞增趨勢，其中莪術醇100? ?μg/mL組G1期細胞占比達（65.53±0.25）%。結果見圖2。

3.4 莪術醇對T47D乳腺癌細胞周期相關基因mRNA表達水平的影響

qRT-PCR檢測結果顯示，與空白對照組比較，不同劑量莪術醇干預T47D乳腺癌細胞48 h后，細胞中PCNA和CDK2的mRNA表達水平均顯著降低（P<0.01），莪術醇100 μg/mL組p21的mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）。結果見圖3A。

3.5 莪術醇對T47D乳腺癌細胞周期相關蛋白表達水平的影響

Western blot檢測結果顯示，與空白對照組比較，不同劑量莪術醇干預T47D乳腺癌細胞48 h后，細胞中CDK2、PCNA、Cyclin D和CDK6的蛋白表達水平隨莪術醇劑量的增加而逐漸降低，部分差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖3B、C。

3.6 莪術醇對T47D乳腺癌細胞內ROS產生的影響

流式細胞術檢測結果顯示，隨著莪術醇劑量增加，細胞內ROS水平顯著增加（P<0.01），詳見圖4A;給予33 μg/mL莪術醇干預6、12、24、48 h后，細胞內ROS水平于24 h達最高，詳見圖4B。因此選取該干預時間進行后續實驗。結果顯示，給予ROS抗氧化劑NAC預處理T47D乳腺癌細胞能夠顯著降低ROS水平，詳見圖4C。

3.7 ROS抗氧化劑NAC對莪術醇干預T47D乳腺癌細胞后細胞周期的影響

流式細胞術檢測結果顯示，給予1 μmol/L的ROS抗氧化劑NAC預處理能夠顯著逆轉莪術醇對T47D乳腺癌細胞的周期阻滯作用，使G1期細胞占比顯著下降（P<0.01）。結果見圖5。

3.8 ROS抗氧化劑NAC對莪術醇干預T47D乳腺癌細胞后Nrf2和Keap1蛋白表達的影響

倒置相差顯微鏡結果顯示，給予1 μmol/L的ROS抗氧化劑NAC預處理能夠逆轉莪術醇對T47D乳腺癌細胞的損傷（圖6），并逆轉莪術醇誘導的ROS相關蛋白Nrf2、Keap1表達的下調（圖7）。

4 討論

在細胞的正常生長過程中，其增殖受細胞周期的嚴格調控。細胞周期包括4個連續的階段：G1期（DNA復制前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）[11]。當細胞周期進程受阻時，細胞的增殖也會被抑制，因此，腫瘤細胞若發生周期阻滯可抑制其增殖。有研究顯示，倍半萜類化合物莪術醇可將腫瘤細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細胞增殖[12]。本研究結果顯示，莪術醇能夠將T47D乳腺癌細胞阻滯在G1期，且呈一定劑量和時間依賴趨勢。研究表明，Cyclin與CDK的復合物對細胞周期G1期的進程起著非常重要的推動作用[13]，而p21則是Cyclin-CDK復合物的抑制劑，能抑制細胞周期G1期和S期的進展[14]。PCNA是評價細胞增殖的重要指標，也與細胞周期調控密切相關。研究發現，PCNA的表達在G1晚期出現，在S期達到峰值，在G2期下降[15]。本研究結果顯示，莪術醇能將T47D乳腺癌細胞有效阻滯于G1期，上調細胞周期進程抑制因子p21的表達，下調細胞周期進程促進因子CDK2、CDK6、Cyclin D和PCNA蛋白的表達，且呈一定劑量依賴趨勢。以上結果表明，莪術醇抑制T47D乳腺癌細胞增殖與其阻滯細胞周期進程、調控細胞周期相關因子的表達有關。

腫瘤細胞中ROS水平較高，其可通過上調抗氧化蛋白緩解ROS增多帶來的影響、維持氧化還原平衡，進而保持促腫瘤信號傳導;而一旦平衡打破致使ROS生成過多，則會促使腫瘤細胞死亡[16]。這表明ROS是抗腫瘤治療的潛在靶點。研究表明，中藥提取物及有效單體通過調控ROS的生成，使ROS的生成超過抗氧化系統的還原能力，從而使細胞處于氧化應激狀態，最終誘導腫瘤細胞凋亡或細胞周期阻滯[17-19]。Nrf2和Keap1作為抗氧化蛋白，是細胞應對氧化應激條件不可或缺的介質，兩者結合定位在細胞質中[20-22]，其表達升高能夠抑制ROS的累積，從而緩解ROS增多對腫瘤細胞的損傷，因此，抑制二者表達能使產生的ROS誘導腫瘤細胞周期阻滯及發生細胞凋亡。本研究結果顯示，莪術醇能誘導T47D乳腺癌細胞中ROS生成增多，而ROS抗氧化劑NAC預處理可逆轉莪術醇引起的ROS升高，同時逆轉莪術醇導致的細胞G1期阻滯，以及逆轉其對ROS相關蛋白Nrf2和Keap1的抑制，說明莪術醇誘導的細胞周期阻滯與ROS生成增多有關。筆者推測莪術醇干預T47D乳腺癌細胞后，導致腫瘤細胞內的Keap1蛋白構象發生變化，使Nrf2與之解離，從而使Nrf2和Keap1表達減少，而其誘導細胞內增多的ROS因此也無法消除，打破了腫瘤細胞內的氧化還原平衡，進而引起T47D乳腺癌細胞周期阻滯。

綜上所述，莪術醇可能通過誘導T47D細胞的氧化應激水平和細胞周期阻滯，抑制細胞的增殖。但本研究僅采用單一細胞系，也未進行體內實驗驗證，莪術醇抗乳腺癌的具體通路機制仍需進一步研究。

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（收稿日期：2021-09-01 修回日期：2021-12-12）

（編輯：舒安琴）

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