葡萄糖添加對不同演替階段森林土壤微生物及酶化學計量特征的影響

王潤超, 陳佳瑞， 王國梁

(1.西北農林科技大學 水土保持研究所, 陜西 楊凌712100; 2.中國科學院 水利部 水土保持研究所, 陜西 楊凌712100)

近些年隨著現代技術手段的發展與相關學科的發展，對森林根系活動和根際微區域的認識不斷深入，根際研究得到了進步和發展。眾所周知，根際在化學、物理和生物學上都是復雜的[1]，植物可以通過根系主動或被動地向周圍土壤釋放一系列化合物，即根系分泌物，根系分泌物由低分子量 (糖、有機酸和氨基酸)和高分子(蛋白質、黏液等)等有機物質組成[2]，它們主動或被動地從根細胞中向周圍土壤釋放，這些滲出物中低分子化合物對微生物至關重要[3]，因為它們不需要合成胞外酶就能被吸收，所以這些化合物是土壤異養生物的有效碳源[4]，而且根系分泌物對土壤微生物區系組成和活性影響的研究由于根系分泌物中含有復雜的有機化合物混合物而變得復雜[5]。因此森林根系分泌物對所在根際微區域內的根系-土壤-微生物的影響成為了全球生態系統碳氮循環研究過程中一個重要環節[6]，亟待我們研究其中的機理[7]。

目前，在根系分泌物對森林生態系統的激發效應和碳氮循環方面已有研究，但根系分泌物中單個組分在多大程度上影響驅動土壤物質循環和微生物群落變化的生物和非生物過程目前仍不清楚[8]。此外，有關森林根系分泌物研究大都僅關注了根系碳源輸入，而忽略了根系分泌物中碳源濃度梯度變化對森林生態系統土壤養分循環的影響，這種忽略將極大地限制對森林根系-土壤-微生物互作機制的深入認識[9]。因此開展根系分泌物碳源濃度梯度變化對森林土壤微生物及酶化學計量特征的影響成為一個十分重要但又極度缺乏的研究課題，尤其在不同森林生態系統中。

黃土高原地處黃河中游，位于我國由東南濕潤、半濕潤氣候向干旱、半干旱氣候過渡的中間地帶，該地區面臨退化生態系統植被恢復的問題[10]。加速黃土高原地區森林生態系統的恢復與重建，對改善西北地區生態環境具有極其重要的意義。因此本研究以黃土高原不同森林生態系統土壤為研究對象，通過人工添加不同濃度的葡萄糖于山楊、油松和遼東櫟土壤中，研究不同森林生態系統中酶化學計量對根系分泌物中糖類的響應機制，為更加科學闡明土壤碳輸入增加對生態系統的影響提供理論支持。

1 研究區域與研究方法

1.1 研究區概況

實驗樣地位于陜西省宜川縣鐵龍灣村，屬于黃土丘陵區。該地屬于暖溫帶半濕潤易旱氣候區[11]，全年氣候變化受制于季風環流，夏季炎熱多雨，降水量312.3 mm，7月最高氣溫29.7℃，1月最低氣溫-6.4℃。山楊林和遼東櫟林為當地原始自然植被，油松林為人工林，1963年植造。土壤主要以灰褐色森林土為主。

1.2 研究方法

1.2.1 土壤采樣 每種林地中設置5塊立地條件相同的樣方，大小為20 m×10 m，相同植物樣地內樣方至少相距20 m。在每個樣方內使用土鉆“S”型隨機取10～15個位點的0—20 cm土層土壤，放入自封袋中，做好標記后放入低溫(4℃左右)冰箱中，盡快運回實驗室進行試驗。回到實驗室后將新鮮土壤樣品過2 mm篩，立即進行室內培養試驗。每種植物土壤分別稱取80 g土放入500 ml梅森瓶中，每個土樣設置3個重復，每個培養瓶土壤水分含量保持在最大田間持水量的60 %，培養溫度為25℃。試驗共4個處理，分別添加葡萄糖為0.1，0.5，1 g/kg干土，分別表示為C0.1，C0.5，C1，以及無添加物的對照處理(CK)。每隔7 d添加一次葡萄糖，對照組添加等量蒸餾水，培養35 d后進行破壞性取樣。

1.2.3 微生物生物量測定 微生物量碳(MBC)和微生物氮(MBN)用氯仿熏蒸提取法測定。每種濃度下均稱取四份土壤樣品，每份2.5 g，其中2份用40 ml 0.5 mol/L的K2SO4溶液萃取，另外2份樣品在真空干燥器中用氯仿避光熏蒸24 h，采用與未熏蒸樣品相同的提取過程。用總有機碳分析儀測定浸提液中的總溶解有機碳和總溶解氮。微生物量碳和氮值乘以轉換系數(kC=0.38，kN=0.45)。土壤微生物量磷(MBP)通過氯仿熏蒸提取法測定。稱取四份土壤樣品，每份土壤樣品2.5 g，其中2份直接用50 ml的0.5 mol/L的NaHCO3(pH=8.5，用NaOH調節)提取，另外兩份熏蒸過程與上述MBC和MBN一致，并用紫外分光光度計測定浸提液中的總溶解磷(kP轉換系數為0.4)。MBC，MBN和MBP均為熏蒸樣品和未熏蒸樣品的差值。

1.2.4 酶測定 稱取3 g鮮土置于125 ml pH=8.2 Tris-HCl溶液中，并用磁選攪拌器攪拌5 min，充分混勻漿水，邊攪拌邊將150 μl土壤懸浮液和50 μl底物溶液加入到96微孔培養板中；陰性對照為150 μl Tris-HCl和50 μl底物溶液；標準微孔為50 μl 10 μmol/L的4-甲基傘形酮(MUB)或7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)和150 μl Tris-HCl緩沖液；淬火微孔為50 μl標準物質和150 μl土壤懸浮液；空白微孔加入50 μl不同酶底物溶液和150 μl Tris-HCl的緩沖液。用German[13]的方法計算酶活性，分別將加完溶液的微孔板放在25℃溫度下培養0.5 h(AP)，2 h(LAP和BG)和4 h(NAG)。培養結束后，加入10 μl lmol/LNaOH終止反應，使用多功能酶標儀測定熒光值，激發波長為365 nm，發射波長為450 nm。

1.2.5 數據分析 利用SPSS 24.0和Excel軟件進行數據處理和統計分析，對同一植被類型不同處理下、同一濃度不同植被類型下各土壤指標進行單因素方差分析((one-way ANOVA)并采用最小顯著性差異法(LSD)進行多重比較；使用Canoco 5.0進行冗余分析(RDA)，揭示各土壤因子對土壤酶及其化學計量的影響。所有圖形均使用Origin 9.0進行繪制。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖添加對不同演替階段森林土壤理化性質的影響

2.2 葡萄糖添加對不同演替階段森林土壤微生物量及化學計量特征的影響

葡萄糖添加顯著改變了不同演替階段森林土壤微生物量C，N，P及其化學計量(圖2)。隨著森林演替，山楊林和遼東櫟林微生物碳(MBC)和微生物氮(MBN)的值顯著大于油松林，均為先減小后增加。隨著森林演替，山楊林和遼東櫟林微生物碳(MBC)和微生物氮(MBN)的值顯著大于油松林，均為先減小后增加。MBN，MBP含量為遼東櫟林顯著大于山楊林，大于油松林。MBC，MBC/MBP含量為山楊林顯著大于遼東櫟林，遼東櫟林顯著大于油松林。MBC/MBN含量為山楊林大于油松林和遼東櫟林，MBN/MBP則與此完全相反。

注：圖中數值為平均值±標準誤差，不同小寫字母代表不同濃度相同植物間的顯著差異，不同大寫字母代表不同植物相同濃度間的顯著差異，下同。

隨著葡萄糖濃度的增加，3種植物MBC和MBN均呈增加趨勢，山楊林MBC在C1增幅最大為14.9%，油松林在C0.5增幅最大為28%，遼東櫟林在C0.1增幅最大為30%。3種森林土壤MBN均在26.2～40.2之間波動。山楊林的MBC/MBN先增加后減小，油松林與之相反，遼東櫟林則一直增加。

山楊林的MBC/MBN與MNC/MBP顯著大于油松林和遼東櫟林。沿葡萄糖濃度梯度山楊林的MBN/MBP一直增加，油松林為先減少后增加，遼東櫟林則為先增加后減小。

圖2 微生物量及化學計量隨葡萄糖濃度增加的變化

2.3 葡萄糖添加對不同演替階段森林土壤酶活性及其化學計量特征的影響

由圖3看出，演替不同階段的林地BG，LAP，NAG，BG/(LAP+NAG)、BG/AP、(LAP+NAG)/AP含量均為遼東櫟林大于山楊林，大于油松林。而AP含量則為山楊林大于遼東櫟林，大于油松林。隨葡萄糖濃度的增加，山楊林AP和NAG活性先減小后增加，BG和LAP活性均呈持續下降。油松林AP和NAG活性先增加后減小，BG活性呈波動趨勢，LAP活性先減小后增加。遼東櫟林AP，BG，LAP和NAG活性均先增加后減小，且遼東櫟林4種酶活性均顯著高于其他兩種植物。BG/(LAP+NAG)中，山楊林持續減少，油松林先增加后減少，遼東櫟林為一定范圍內波動。BG/AP中山楊林和遼東櫟林均為持續下降，油松林在一定范圍內波動。遼東櫟林BG/(LAP+NAG),BG/AP顯著高于其他油松林和山楊林。山楊林和遼東櫟林的(LAP+NAG)/AP均先增加后減小，油松林則為先減小后增大。在對土壤酶活性數據進行標準化處理后，遼東櫟林lnBG/ln(LAP+NAG)，lnBG/lnAP在各個濃度均顯著大于油松林與山楊林。

2.4 土壤微生物量、酶與影響因子之間的關系

圖3 土壤酶活性及化學計量隨葡萄糖濃度增加的變化

3 討 論

3.1 葡萄糖對土壤理化性質、微生物量及土壤酶活性的影響

圖4 土壤酶化學計量隨葡萄糖濃度增加的變化

細胞外酶化學計量學(酶的相對豐度)反映了微生物對養分的需求和環境對養分的供給[18]，在生態系統的生物地球化學平衡過程中起著關鍵作用。然而，不同土壤養分對酶活性的影響仍有爭議，本試驗中3種林分土壤酶活性與CK相比，均隨葡萄糖濃度增加而升高。根系分泌物C源輸入中小分子化合物為易于土壤微生物直接利用的含碳有機物，C源添加改變了土壤C/N與N/P，研究結果表明C源輸入改變土壤養分的有效性，進而調節微生物的生理代謝，并最終反映在生態酶的表達中。土壤養分狀況影響生態酶的產生和活性這可以用“資源配置理論”解釋[19]，即資源的可獲得性調節微生物和植物合成和分泌生態酶。

圖5 土壤酶及微生物量與各因子之間的關系

3.2 葡萄糖對不同森林生態系統土壤酶化學計量特征及微生物養分限制的影響

在本研究中，RDA結果表明，土壤酶、微生物量及其化學計量比分別與AP，TN，AMN有著顯著性正相關關系，此外與土壤SOC和MBC呈顯著正相關，說明不同林地在P元素水平一致的情況下，SOC，TN的變化顯著影響土壤酶活性。隨著葡萄糖濃度增加，土壤MBC含量增加，土壤酶C/P比值增加，土壤N和P的有效性改變，土壤微生物會增加參與N和P循環的酶的產生，以滿足他們對這些營養元素的需求[20]。在各葡萄糖濃度，遼東櫟林和山楊林土壤N/P及土壤酶N/P均顯著大于油松林土壤，說明油松林比山楊林和遼東櫟林具有更強的N顯著。此外，3種林地土壤酶活性中，遼東櫟林在C0.5的N/P減小的幅度最大，為35%，且AP活性在C0.5,C1增加最多，說明高濃度葡萄糖加劇了遼東櫟林土壤的P限制。此外，隨葡萄糖濃度增加，遼東櫟林微生物增加量顯著大于山楊林與遼東櫟林，微生物的增加也加劇了P限制。這與Ren等[21]研究結果一致，P是一種“巖石衍生”元素，很難從大氣中大量獲取。堿性土壤中植物的消耗以及鈣和鎂離子的吸附導致植被演替過程中磷的生物利用度顯著下降[22]，從而導致P限制。

土壤pH值也與土壤生態酶活性和化學計量顯著相關，因為每種土壤生態酶都有自己的最佳pH值[23]。在本研究中，土壤pH值與AP呈負相關，但與土壤C/P和N/P呈正相關。低pH值條件會增強P的地球化學吸附并阻止P在土壤中的遷移[24]，導致土壤P的有效性下降。這種現象最終刺激土壤微生物響應磷的需求而合成更多的AP酶[20]。然而，土壤pH值與BG和NAG+LAP呈負相關，這與Xu等獲得的結果相反。這些差異可能是由于兩項研究之間的土壤pH值范圍差異引起的。例如，在我們的研究中，高濃度葡萄糖添加均增加了3種林分土壤pH值，使得pH值的范圍在7.42～8.41，在Xu等的研究中，pH值的范圍為5.43～6.93。總而言之，外源性碳添加對生態酶活性和化學計量的影響是通過影響土壤物理性質，間接影響植物和微生物的細胞代謝以及間接調節環境養分利用率來實現的。

本文研究發現，葡萄糖顯著影響了3種植物土壤酶化學計量C/N和N/P與土壤C/P和N/P，這與前人的研究一致[25]。添加葡萄糖能使微生物數量增加，微生物量數量與葡萄糖濃度呈正比，土壤酶活性化學計量會隨土壤和微生物量化學計量的變化而發生變化。這說明土壤胞外酶活性并不是處于動態平衡狀態之中，而是依賴于土壤和微生物生物量的化學計量。因此，葡萄糖影響不同演替階段的植物土壤酶活性化學計量是通過土壤-微生物反饋與土壤養分循環共同影響。

4 結 論

總之，葡萄糖添加處理促進了3種林分土壤激發效應而降低了土壤TN含量，且增加了油松林的N限制和遼東櫟林的P限制。因此植物根系分泌物中碳的輸入可能降低了森林土壤養分活性，增加微生物數量的同時，增加土壤N，P元素的限制，進而影響根際土壤有機質分解和養分代謝等過程。但需要說明的是，我們的研究中模擬根系分泌物葡萄糖添加處理時間僅持續35 d，為進一步探究根系分泌物碳輸入對森林演替過程的長期影響，需要我們進一步深入開展根系分泌物對森林生態系統根際范圍內的長期野外碳原位添加的研究。