苔蘚結(jié)皮及其下層土壤的胞外酶活性與微生物CUE特征

張尚鵬, 王百群, 晁赫嶸, 王雨涵

(1.中國科學(xué)院 水利部 水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室,陜西 楊凌 712100; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院, 陜西 楊凌 712100)

生物土壤結(jié)皮是由非維管束植物如藻類、地衣、苔蘚和土壤表面的微生物與土壤顆粒通過團聚和膠結(jié)作用所形成的地表覆被物[1]。生物土壤結(jié)皮的發(fā)育能夠加固地表土壤，增強土壤的抗侵蝕能力[2]，影響水分重新分配[3]，改善微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性等[4]。苔蘚結(jié)皮被認為是生物土壤結(jié)皮發(fā)育的后期階段[5]，其養(yǎng)分狀況較發(fā)育前期有較大改善，為微生物生長提供更適宜的條件。

土壤中的微生物能夠通過產(chǎn)生胞外酶來進一步催化分解復(fù)雜的有機物質(zhì)，釋放可供微生物同化的C，N，P養(yǎng)分[6]，胞外酶被認為是微生物獲取養(yǎng)分的重要催化劑[7]，在參與土壤的物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。土壤酶的活性特征能夠作為評價土壤的養(yǎng)分狀況以及微生物群落代謝的有效指標[8]。微生物C利用效率(CUE)被定義為土壤微生物生長速率與有機質(zhì)吸收速率的比值，其范圍為0.1～0.6[9-10]。通常情況下，具有高CUE的微生物群落可以有效地將C保留在新生物量中，而低CUE則意味著C的損失[11]。苔蘚結(jié)皮會對結(jié)皮層養(yǎng)分起到積極作用，而對其下層土壤的土壤酶活性和C利用狀況尚不清楚。因此，本研究選擇黃土高原退耕地上生長的苔蘚結(jié)皮及下層土壤為研究對象，通過探究剖面尺度下的養(yǎng)分狀況、土壤酶活性和微生物CUE特征，進一步明確苔蘚結(jié)皮對下層土壤養(yǎng)分的影響及微生物對養(yǎng)分的利用情況，為深入了解生物結(jié)皮參與的生物地球化學(xué)循環(huán)及其生態(tài)效應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點位于陜西省安塞縣(109°19′E，36°51′N)。地貌類型為典型的黃土丘陵，平均海拔在1 200 m左右。該區(qū)年均溫8.8℃，年均降水量300～650 mm，年日照時數(shù)約2 400 h，屬于暖溫帶半干旱季風(fēng)氣候。土壤類型以黃綿土為主，分布的地帶性植被主要有胡枝子(Lespedezabicolor)、白蓮蒿(Artemisiastechmanniana)、長芒草(Stipabungeana)、沙棘(Hippophaerhamnoides)、茵陳蒿(Artemisiacapillaries)等。

1.2 樣品采集

本研究于2020年8月對樣品進行采集，在安塞縣周邊流域選擇海拔一致，人為擾動少且苔蘚結(jié)皮發(fā)育完整的退耕地作為采樣點。共設(shè)置4個樣地(表1)，在每個樣地采集苔蘚結(jié)皮以及其下層0—2 cm，2—5 cm和10—20 cm的土壤。在每個樣地中，按照隨機采樣和多點混合的原則采集樣品，各個深度的樣品按照5～7點采樣并最終混合為一個分析樣品。每份樣品過2 mm篩并去除石頭和植物體等雜質(zhì)，將每個樣本分為兩個子樣本，一份樣本風(fēng)干后用于理化性質(zhì)測定，另一份樣本立即放在4℃冰箱中保存，兩周內(nèi)用于酶活性和微生物量分析。

表1 樣地基本信息

1.3 樣品測定

參考《土壤農(nóng)化分析》第三版[12]測定土壤理化性質(zhì)。用電位法(水土比為2.5∶1)測定pH值；土壤含水量用烘干法測定；采用重鉻酸鉀—外加熱法測定土壤有機碳(SOC)的含量；土壤全氮(TN)含量使用凱氏定氮法測定(KjeltecTM2399，瑞典)；可溶性有機氮(DON)和可溶性有機碳(DOC)利用MultiC/N3100測定；分別用濃硫酸—高氯酸和0.5 mol/L的碳酸氫鈉處理土壤，用鉬銻抗—紫外分光光度法測定全磷(TP)和速效磷(Olsen-P)含量(Hitachi UV2300)。

采用氯仿熏蒸法來測定土壤微生物量碳(MBC)、微生物量氮(MBN)和微生物量磷(MBP)的含量[13]，用0.5 mol/L濃度的K2SO4浸提C和N，0.5 mol/L濃度的NaHCO3浸提P，將未熏蒸樣品和熏蒸樣品間的差值作為微生物量，其中MBC，MBN和MBP的轉(zhuǎn)化系數(shù)分別為0.45，0.54，0.40。酶活性均采用微孔板熒光法進行測定[11,14]，其中參與碳氮磷循環(huán)的水解酶分別是：β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)、β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、堿性磷酸酶(AP)。

1.4 計算方法

胞外酶活性的計算公式為[15]：

Ab=FV/(eV1tm)

(1)

F=(f-fb)/q-fs

(2)

e=fr/(csV2)

(3)

q=(fq-fb)/fr

(4)

式中:Ab為樣品酶活性[nmol/(g干土·h)];F為校正后樣品熒光值;V為懸濁液的總體積;e為熒光釋放系數(shù);V1為微孔板每個孔中加入的樣品懸濁液體積;t為培養(yǎng)時間;m為干土樣的質(zhì)量;f為酶標儀所讀取樣品的熒光值;fb為空白對照孔的熒光值;q為淬火系數(shù);fs為陰性對照微孔的熒光值;fr為參考標準孔的熒光值;cs為參考標準孔的濃度;V2為所加入?yún)⒖紭藴饰矬w積;fq為淬火標準孔的熒光值。

微生物CUE計算采用生物地球化學(xué)平衡模型[16]：

CUE=CUEmax×{(SC∶N×SC∶P)/[(KC∶N+SC∶N)×(KC∶P+SC∶P)]}0.5

(5)

SC∶N=BC∶N/LC∶N×1/EEAC∶N

(6)

SC∶P=BC∶P/LC∶P×1/EEAC∶P

(7)

式中:EEAC∶N為BG/NAG,EEAC∶P為BG/AP。KC∶N和KC∶P是基于有效性C,N,P的CUE半飽和常數(shù)。假設(shè)模型的KC∶N和KC∶P為0.5,CUEmax為0.6。BC∶N和BC∶P分別為微生物量C∶N和C∶P。用速效態(tài)養(yǎng)分比值作為LC∶N和LC∶P。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey test多重比較檢驗不同深度間的理化性質(zhì)、微生物量、酶活性和微生物CUE的差異性。采用廣義線性模型來確定養(yǎng)分計量與微生物量計量間的關(guān)系判斷元素內(nèi)穩(wěn)態(tài)。利用R軟件“Vegan”包的“varpart”函數(shù)進行方差分解分析(VPA)，使用“relaimpo”包中的線性模型確定每個變量對微生物CUE的相對影響。所有分析和繪圖分別在軟件R(v.3.6.3)和軟件Origin 2021中進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 苔蘚結(jié)皮及下層土壤理化性質(zhì)特征

不同土壤理化性質(zhì)在剖面尺度上表現(xiàn)出明顯差異(表2)。土壤養(yǎng)分含量均呈現(xiàn)隨著深度的加深而降低，蘚結(jié)皮層的養(yǎng)分含量顯著高于其他土層(p< 0.05)。蘚結(jié)皮層的SOC，TN，TP，DOC，DON和Olsen-P含量分別是10—20 cm土壤養(yǎng)分的2.58，2.34，1.13，2.30，4.30，7.36倍。而蘚結(jié)皮及不同深度土壤間的含水量沒有表現(xiàn)出顯著差異。蘚結(jié)皮層的pH值(7.78±0.07)顯著低于其他土層(p< 0.05)，盡管在0—2 cm，2—5 cm和10—20 cm之間差異性不顯著，但在數(shù)值上表現(xiàn)為隨著土層深度的增加而增加。可見，在剖面尺度上，養(yǎng)分主要集中在表層，且表層pH值較低。

表2 苔蘚結(jié)皮及下層土壤理化性質(zhì)特征

2.2 苔蘚結(jié)皮及下層土壤微生物量與內(nèi)穩(wěn)態(tài)特征

表3展示了蘚結(jié)皮剖面尺度下土壤的微生物生物量變化。與土壤養(yǎng)分分布特征類似，微生物生物量碳、氮、磷均在蘚結(jié)皮層最高(p< 0.05)，分別為(2 981±223) mg/kg，(270±24.7) mg/kg，(21.3±2.43) mg/kg。隨著深度的增加進一步降低，結(jié)皮層的微生物生物量碳、氮、磷分別是10—20 cm土壤的15.9，32.3，9.94倍。進一步通過分析土壤養(yǎng)分與微生物生物量之間的關(guān)系，來確定微生物體的化學(xué)計量內(nèi)穩(wěn)態(tài)強度(圖1)。無論是C∶N，C∶P和N∶P，土壤養(yǎng)分與微生物生物量之間均不存在明顯的相關(guān)性(p> 0.05)。這反映了微生物可保持其本身的元素平衡，微生物群落存在很強的元素內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

表3 苔蘚結(jié)皮及下層土壤微生物生物量 mg/kg

注：微生物生物量計量比與土壤養(yǎng)分計量比之間的關(guān)系。若斜率≈1且顯著(p<0.05)表示穩(wěn)態(tài)較弱或不穩(wěn)定，若回歸斜率?1且不顯著(p>0.05)表示化學(xué)計量穩(wěn)態(tài)較強。

2.3 苔蘚結(jié)皮及下層土壤胞外酶活性特征

土壤胞外酶活性在不同土層深度之間存在顯著差異(圖2)。隨土層深度的增加，BG逐漸降低，而NAG和AP則表現(xiàn)為先降低后增加的趨勢。BG和NAG的最高值出現(xiàn)在結(jié)皮層(p<0.05)，為(3 684±263) nmol/(g·SOM·h)和(413±84.2) nmol/(g·SOM·h)，AP的最高值則出現(xiàn)在10—20 cm土層深度，其酶活性為(6 966±572) nmol/(g·SOM·h)。NAG和AP的酶活性在0—2 cm和2—5 cm的土層間沒有顯著差異(p> 0.05)。

注：BG表示β-1,4-葡萄糖苷酶[nmol/(g·SOM·h)]；NAG表示β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶[nmol/(g·SOM·h)]；AP表示堿性磷酸酶[nmol/(g·SOM·h)]。不同小寫字母表示不同深度土壤間差異顯著(p< 0.05)。

2.4 剖面尺度下的CUE變化特征及影響因素

微生物C利用效率(CUE)在不同土層深度下存在顯著差異，其平均值為0.25(p< 0.05，圖3)。CUE隨土層深度加深呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，最大值出現(xiàn)在10—20 cm(0.36±0.05)，最小值出現(xiàn)在0—2 cm(0.13±0.01)。結(jié)合方差分解(VPA)分析了土壤養(yǎng)分和土壤酶對CUE變化的解釋程度(圖4A)，其中土壤養(yǎng)分可解釋63%，土壤酶可解釋83%，二者共同解釋部分占49%。進一步結(jié)合線性模型分析各變量對CUE變化的相對重要度(圖4B)，結(jié)果與VPA一致，土壤酶的相對影響更大。其中BG，NAG和AP的相對影響分別為14.0%，30.9%和23.4%，土壤養(yǎng)分中TP的相對影響最大，為8.87%。

3 討 論

苔蘚結(jié)皮的發(fā)育提高了表層土壤的養(yǎng)分含量和微生物生物量。在本研究中，結(jié)皮層的有機碳、全氮、全磷、可溶性有機碳、可溶性有機氮和速效磷含量均顯著高于其他深度的土壤(表2)，這與以往的研究結(jié)果類似。Li等[17]研究結(jié)果指出蘚結(jié)皮層的養(yǎng)分含量高于地下部；明姣等[18]研究發(fā)現(xiàn)生物結(jié)皮對土壤中氮含量的影響主要集中在結(jié)皮層；張國秀等[19]指出結(jié)皮層的全磷與速效磷含量均顯著高于下層土壤，有效磷含量為3.27～5.87 mg/kg。生物結(jié)皮發(fā)育過程中土壤含水量會進一步增加[20]，發(fā)育到蘚結(jié)皮最高。而本研究選擇蘚結(jié)皮為研究對象，由于表層的水分積累導(dǎo)致與下層土壤間的差異不顯著。此外，生物結(jié)皮在發(fā)育過程中，能夠釋放有機酸來促進土壤中難溶性有機物質(zhì)的分解[21]，以滿足本身的養(yǎng)分需求，是造成表層土壤pH較低的重要原因。由于結(jié)皮層充足的土壤養(yǎng)分與適宜的生存條件，使結(jié)皮層的微生物量顯著高于下層土壤(表3)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)剖面尺度的微生物群落保持著較為穩(wěn)定的化學(xué)計量內(nèi)穩(wěn)態(tài)(圖1)，微生物可以通過酶的合成等過程來保持自身C，N，P的計量平衡[22]。

注：不同小寫字母表示不同深度土壤間差異顯著(p<0.05)。

參與C，N，P循環(huán)的相關(guān)酶活性在剖面尺度上表現(xiàn)出明顯差異。BG，NAG和AP這3種酶均在結(jié)皮層表現(xiàn)出較高的活性(圖2)，而結(jié)皮層的微生物量也是最高的，這反映了結(jié)皮層中微生物參與C，N，P代謝的速率更大，微生物增加了對養(yǎng)分的需求用于增加自身生物量[23]。隨土層深度的增加，酶活性呈現(xiàn)出不同程度的降低，但NAG和AP在10—20 cm深度表現(xiàn)為較高的酶活性(圖2B和2C)。這可能是由于隨土層的加深，N和P元素的含量不能滿足微生物的需求，在這種養(yǎng)分虧缺的情況下微生物通過分泌N和P的相關(guān)酶到環(huán)境中來活化相應(yīng)的養(yǎng)分[7]。以往的研究指出，生物結(jié)皮具有固氮和溶磷的作用[19,24]，因此結(jié)皮層可認為是整個剖面尺度上重要的養(yǎng)分輸入層。此外，結(jié)皮層的DOC，DON和Olsen-P含量分別是10—20 cm深度土壤的2.30，4.29，7.36倍(表2)，也進一步說明了N，P元素受到結(jié)皮層更少的養(yǎng)分補充，以至于微生物需要釋放相關(guān)胞外酶來活化養(yǎng)分。由此可見，土壤的養(yǎng)分狀況會影響到酶活性大小。

注：方差分解(A)與線性模型(B)分析土壤養(yǎng)分和土壤酶對CUE的解釋程度與相對貢獻。

本研究發(fā)現(xiàn)微生物CUE在剖面尺度上的平均值為0.25(圖3)，與以往結(jié)果類似。Giorgio等[25]指出全球的平均水平為0.26，陸地生態(tài)系統(tǒng)微生物C利用效率平均約為0.30[26-27]。在剖面尺度上，微生物CUE隨深度的增加呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(圖3)。VPA與線性模型結(jié)果表明土壤養(yǎng)分與土壤酶均對CUE變化呈現(xiàn)較高的解釋度(圖4)。結(jié)皮層充足的可利用性養(yǎng)分條件有助于微生物生長與代謝，以及提高參與轉(zhuǎn)化為新的生物量的效率[16]。此外，激發(fā)效應(yīng)也會影響到微生物的CUE[11]。結(jié)皮層會受到地上部的植物凋落物和根系分泌物的影響，短暫或連續(xù)的物質(zhì)輸入會引起有機質(zhì)周轉(zhuǎn)的變化[28]，而周轉(zhuǎn)中的養(yǎng)分能夠以微生物生物量的形式被固定在土壤中。受到養(yǎng)分供應(yīng)的影響，隨深度增加微生物CUE逐漸降低，但10—20 cm土層深度的微生物CUE增大。這可能是由于深層土壤較低的微生物量，使其對養(yǎng)分的需求明顯低于表層。此外，由于N，P元素的匱缺促進了微生物對NAG和AP的分泌，而酶的釋放會消耗土壤中的部分C[10]，微生物依然能夠保持較高的CUE，反映了土壤中的C含量仍能滿足微生物的需求，這與BG酶活性隨深度逐漸降低的結(jié)果是一致的(圖2A)。

4 結(jié) 論

(1) 苔蘚結(jié)皮的發(fā)育提高了表層土壤的養(yǎng)分含量和微生物生物量，在剖面尺度上，養(yǎng)分含量和微生物生物量隨深度增加而逐漸降低。

(2) 微生物群落保持較為穩(wěn)定的化學(xué)計量內(nèi)穩(wěn)態(tài)。BG的酶活性隨深度增加而逐漸降低，NAG和AP的酶活性先降低后升高，反映了10—20 cm深度的N，P養(yǎng)分匱乏。

(3) 在剖面尺度上，微生物CUE隨深度的增加呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，表層與底層土壤都有助于微生物對C的固存，其中土壤養(yǎng)分與土壤酶是影響CUE的關(guān)鍵因素。