干式熒光發光法在HIV感染初篩中的應用價值

黃 山，孫溪若，呂松琴，許寶妹，聶 磊，王義娜，李曉非

[1.昆明市第三人民醫院（云南省傳染性疾病臨床醫學中心），云南 昆明 650041；2.上海榮盛生物藥業有限公司，上海 201108]

在人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的初篩試驗中[1]，酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）因有較好的敏感性和特異性，對場地和設備要求不高，所以應用最為廣泛[2]，但存在檢測耗時長、需手工操作、易出錯、易污染等缺點[3]。因此，為了克服ELISA的不足，臨床亟需一種可自動操作、簡便、檢測耗時短的HIV初篩方法。本研究擬初步探討干式熒光發光法在HIV感染篩查中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年6月1日—12月31日昆明市第三人民醫院感染一科收治的疑似HIV感染患者351例，其中男186例、女165例，年齡（47.79±12.35）歲。收集所有患者的血清樣本，對所有HIV抗體篩查試驗有反應的樣本采用HIV確證試驗（免疫印跡法）檢測，最終確認HIV抗體陽性165例、陰性186例。本研究經昆明市第三人民醫院倫理委員會審核通過，研究前向患者及家屬講述本研究的目的和實施方案，征得同意后并簽署知情同意書，臨床試驗嚴格遵循赫爾辛基宣言和中國有關臨床試驗研究規范、法規進行。

1.2 儀器與試劑

HIV檢測試劑盒（干式熒光發光法）、HIV診斷試劑盒（ELISA）均購自上海榮盛生物藥業有限公司。人類免疫缺陷病毒（HIV 1+2型）抗體檢測試劑盒（免疫印跡法）購自新加坡MP生物醫學亞太私人有限公司。AFS-1000干式熒光免疫分析儀、AFS-1200干式熒光免疫分析儀均購自廣州藍勃生物科技有限公司，ELX808酶標儀、ELX50洗板機均購自美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 HIV抗體補充試驗 采用人類免疫缺陷病毒（HIV1+2型）抗體檢測試劑盒（免疫印跡法）檢測HIV，嚴格按試劑盒說明書操作，根據試劑說明書提供的標準判定陰陽性。

1.3.2 HIV篩查實驗 （1）干式熒光發光法：嚴格按試劑盒說明書操作。吸取100 μL血清，滴加到試劑卡的加樣孔中，反應15 min后立即上機檢測，S/CO值≥1為陽性，S/CO值＜1為陰性。（2）ELISA：嚴格按試劑盒說明書操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。呈非正態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以率或例表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kappa值評估2種方法之間的一致性。采用Spearman相關分析評估2種方法的相關性。以HIV確證試驗（免疫印跡法）為金標準，分別計算2種方法的敏感性、特異性、準確性、陽性預測值和陰性預測值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 干式熒光發光法與ELISA S/CO值的比較

ELISA的S/CO值為0.233（0.156～17.453），顯著高于干式熒光發光法[0.573（0.132～2.432）]（Z=5.608，P＜0.001）。見圖1。

圖1 干式熒光發光法與ELISA的S/CO值比較

趨勢分析結果顯示，干式熒光發光法的S/CO值隨ELISA S/CO值的升高而升高，呈正相關（r=0.715，P＜0.001）。在ELISA S/CO值=31.639和干式熒光發光法S/CO值=2.432時，2種方法的趨勢線交叉，自該交叉點起，隨著檢測結果數的增多，ELISA S/CO值的升高趨勢更明顯。見圖2。

圖2 干式熒光發光法與ELISA的S/CO值趨勢比較

2.2 干式熒光發光法與ELISA的檢測性能分析

以HIV確證試驗（免疫印跡法）為金標準，在351例樣本中，干式熒光發光法陽性165例、陰性186例，ELISA陽性168例、陰性183例。2種方法的敏感性、特異性、準確性、陽性預測值和陰性預測值差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 干式熒光發光法與ELISA的檢測性能分析

干式熒光發光法與ELISA的陽性符合率為95.83%（161/168），陰性符合率為97.27%（178/183），總符合率為96.58%（339/351），一致性好（Kappa=0.931）。

3 討論

在HIV篩查試驗中，ELISA對儀器、設備要求不高，且具有較高的敏感性和特異性，因此應用最為廣泛[4]。但ELISA從加樣到結果判讀需要2個多小時，從加樣一直到最后的終止反應，所有檢測步驟基本為手工操作，極易出錯或被污染。當操作出錯或受污染時，多數情況下需重新檢測，不僅浪費了人力、物力，提高了檢測成本[5]，還會耽誤患者的就診、確診時間[6]。干式熒光發光法僅需一臺小型熒光免疫分析儀，對設備的要求比ELISA更低，一份樣本的檢測時長只需15 min，整個檢測過程不涉及大量的手工操作，滴加樣本后只用等待上機判讀結果，出錯或被污染的概率很低。該技術采用雙抗原夾心法原理設計[7]，在硝酸纖維素膜檢測線（T線）位置包被HIV重組抗原1，檢測時樣本中的待測物先與固化在玻璃纖維上的熒光微球標記的HIV重組抗原2結合，并繼續向硝酸纖維素膜層析，通過硝酸纖維素膜T線時，被包被在硝酸纖維素膜上的HIV重組抗原1捕獲。在熒光免疫分析儀上檢測時，陽性樣本的T線產生明顯信號，熒光數值的高低與樣本中的待測物濃度成正比。在硝酸纖維膜質控線（C線）包被羊抗兔多克隆抗體，在玻璃纖維膜上固化有熒光微球標記的兔IgG，無論樣本中是否含有待測物，C線羊抗兔多克隆抗體始終可以捕獲兔IgG熒光標記物，因此C線始終有熒光信號產生。

本研究結果顯示，干式熒光發光法檢測HIV的敏感性和特異性均＞90%，準確性高。與ELISA比較，雖然2種方法的S/CO值存在顯著差異，但變化趨勢基本一致，陽性符合率、陰性符合率和總符合率均＞90%，一致性好（Kappa=0.931）。由此可見，干式熒光發光法與ELISA具有較高的一致性。

綜上所述，干式熒光發光法各項檢測性能與ELISA相當，且具備檢測快速、操作簡便等優勢，在檢驗技術人員緊缺、場地及設備受限的部分欠發達地區和基層醫院可采用該技術開展HIV抗體篩查；該技術也為即時檢驗[8]及HIV快速檢測替代策略[9]提供了一種適宜的選擇，具有很好的應用前景。