2013—2020年四川大學華西醫院寄生蟲形態學室間質量評價結果分析

鄧山鷹，裴雨晴，張春瑩，謝 恒，蒙 強，馬 瑩

（四川大學華西醫院實驗醫學科，四川 成都 610041）

室間質量評價（external quality assessment，EQA）又被稱為能力驗證，是促進檢測結果準確性與可靠性的有效措施，目的在于評價實驗室的能力，確認實驗室間的差異。美國病理家學會（the College of American Pathologists，CAP）的寄生蟲檢測能力比對采用糞便濕片樣本，要求參加者自行涂片后鏡檢，樣本和操作與臨床一致，不僅考核檢驗人員辨認寄生蟲的能力，也考核其發現寄生蟲的能力。我國國家衛生健康委臨床檢驗中心（簡稱臨檢中心）寄生蟲形態學室間質量評價活動采用通過圖片識別寄生蟲形態的形式，客觀、有效地考評檢驗人員寄生蟲識別能力。本研究對2013—2020年四川大學華西醫院參加CAP和臨檢中心寄生蟲形態學EQA的結果進行回顧分析，并結合工作實際，歸納了相似寄生蟲（卵）的形態特征。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2013—2020年四川大學華西醫院寄生蟲形態學EQA的200份樣本的回報結果，其中CAP 80份，臨檢中心120份。

1.2 方法

1.2.1 CAP樣本檢測 CAP寄生蟲形態學EQA每年3次，每次5個樣本。由于海關原因，2014、2017年只有2次，2016、2020年0次。每次收到樣本后，均嚴格按第4版《全國臨床檢驗操作規程》中寄生蟲濕片檢查的要求進行操作[1]，將樣本混勻后，滴1滴在潔凈載玻片上，蓋上蓋玻片，涂片厚度以透過玻片可隱約辨認書上字跡為宜。先在低倍鏡下按從左到右、從上到下的順序查找全片；找到疑似寄生蟲（卵）后，在高倍鏡下觀察細微結構；計數全片查見的寄生蟲（卵）數量，1～2個蟲卵為少量，3～9個為中等量，≥10個為大量。檢測結果包括查見的寄生蟲（卵）種類和數量。將結果在線報告給CAP后，CAP以線上形式回報，并對所有參評實驗室的結果做出評價。

1.2.2 臨檢中心樣本檢測 臨檢中心寄生蟲形態學EQA每年1次，每次15張圖片，每張圖片上附有寄生蟲大小、染色方法、放大倍數等信息。由科室所有寄生蟲檢測人員輪流、獨立進行形態識別，可參閱相關形態學圖譜[2-3]，將其中1位檢測人員的檢測結果作為實驗室結果在線上報，臨檢中心以線上形式回報結果，并對結果做出評價。

2 結果

2.1 識別正確率

80份CAP樣本中，有77份識別正確，3份識別錯誤，12份未評分，正確率為96.3%；120份臨檢中心樣本中，118份識別正確，2份識別錯誤，正確率為98.3%。全部200份樣本的正確率為97.5%。5次識別錯誤的寄生蟲見表1。

表1 2013—2020年EQA寄生蟲識別錯誤結果

200份CAP與臨檢中心樣本涉及30種寄生蟲的47種不同生活史形態，包括醫學原蟲、醫學蠕蟲和醫學節肢動物。具體蟲種和不同生活史形態見表2。

表2 2013—2020年EQA涉及寄生蟲蟲種和生活史形態

CAP樣本存在寄生蟲量分布不均，且同一樣本含多種寄生蟲（卵）的情況，只有評審員與所有參評實驗室在該樣本的上報一致性比例均＞80%時才會評分。8年中，本實驗室上報的樣本中共有12份未評分，其中11份均是評審員和參評實驗室缺乏共識；而對于樣本2013 P3-17，雖然選擇查見寄生蟲的參評實驗室中有97.4%鑒定為藍氏賈第鞭毛蟲包囊，但由于有25.0%的參評實驗室未查見寄生蟲，所以該樣本被判定為有問題樣本而未評分；具體情況見表3。未評分樣本中易漏檢、難辨認原蟲的鑒別特征見表4。

表3 2013—2020年CAP寄生蟲EQA未評分樣本

表4 未評分樣本中易漏檢且較難辨認原蟲鑒別特征

3 討論

2013—2020年，CAP和臨檢中心寄生蟲EQA樣本中出現了30種寄生的47種生活史形態。CAP樣本由于是糞便樣本，所考核的寄生蟲（卵）均是腸道寄生蟲，以藍氏賈第鞭毛蟲包囊出現次數最多，其次是鞭蟲卵、鉤蟲卵、糞類圓線蟲幼蟲和帶絳蟲卵。臨檢中心的考核是以圖片的形式，除涉及腸道寄生蟲外，還包括血液、骨髓、組織、體液樣本中出現的寄生蟲，以瘧原蟲的各種形態出現次數最多，其次是華支睪吸蟲（卵）、日本血吸蟲（卵）、蛔蟲卵、肺吸蟲（卵）、微絲蚴。由于地域的差異和考評形式的不同，CAP與臨檢中心的EQA側重點稍有不同，故而考核的內容可以在一定程度上互補。本實驗室近幾年在實際工作中發現的寄生蟲以鉤蟲卵為主，其次是人芽囊原蟲、藍氏賈第鞭毛蟲包囊、華支睪吸蟲卵與絳蟲卵，所有寄生蟲類型均在EQA考核范圍內。

從本實驗室5次樣本識別錯誤的原因來看，臨檢中心的2次樣本識別錯誤均是由于圖片中寄生蟲的特殊形態結構不清晰所造成：結腸內阿米巴滋養體與溶組織阿米巴滋養體的主要鑒別要點在于核仁，前者核仁大，略偏位，核周染色質大小不一；后者核仁小，居中，核周染色質大小一致，常生出指狀或舌狀單一的偽足（圖1），因該圖片核仁不明顯，影響了檢測人員的判斷。馬來微絲蚴與班氏微絲蚴的主要鑒別要點在于體核與尾核，前者體核不均，有2個尾核前后排列；后者體核均勻，無尾核（圖2）。從臨檢中心考核微絲蚴的圖片上可以看出，每幅圖中只有1條微絲蚴，且個別圖片中的結構特點比較模糊，無法從體核跟尾核上準確判斷是哪種微絲蚴，增加了辨認的難度。在實際工作中，微絲蚴往往不止1條，便于特殊結構的觀察，建議臨檢中心可以在同一圖片上展示多條微絲蚴，以便參評實驗室更好地識別。

圖1 結腸內阿米巴滋養體與溶組織阿米巴滋養體（三原染色，×1 000）（圖片來源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html）

圖2 馬來微絲蚴與班氏微絲蚴（吉姆薩氏染色，×1 000）（圖片來源于臨檢中心）

CAP識別錯誤中，有1次是在識別出姜片/肝片蟲卵的同時，把不典型的蟲卵誤認為是裂頭絳蟲卵，同時上報了2種蟲卵，被判定為錯誤。闊節裂頭絳蟲卵、肺吸蟲卵、姜片蟲卵、肝片吸蟲卵形態相似，應注意鑒別。通過對幾種蟲卵進行復習、比較和觀察，總結了它們各自的形態特點，除姜片蟲卵和肝片蟲卵在光鏡下較難區別外，其他幾種蟲卵均可以通過各自的特點，如蟲卵的大小、卵殼的厚薄、卵蓋的大小和形態進行鑒別：闊節裂頭絳蟲卵為淺灰褐色，大小為（58～76）μm×（40～51）μm，有卵蓋和小棘；肺吸蟲卵為金黃色，較闊節裂頭絳蟲卵大[（68～118）μm×（39～67）μm]，卵殼厚薄不均，卵蓋扁平且寬；姜片蟲卵為淡黃色，卵殼薄、卵蓋小且不明顯，是常見蠕蟲卵中最大的蟲卵[（130～150）μm×（60～90）μm]（圖3）。另外2次CAP錯誤都是由于樣本中寄生蟲（卵）數量少而漏檢，其中1次是漏了樣本中的糞類圓線蟲幼蟲，上報了鞭蟲卵。從回報結果可以看出，有33.3%的評審員與18.3%的參評實驗室均看到了鞭蟲卵，有42.9%的參評實驗室未查見寄生蟲，說明該樣本中寄生蟲的量存在分布不均的情況。

圖3 有卵蓋且形態相似的寄生蟲卵（0.9% NaCl溶液涂片，×400）（圖片來源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html）

從CAP的回報結果中不僅可以看到所有參評實驗室在各個樣本中檢出的寄生蟲（卵）分布情況，而且資料中還會說明該樣本考核的目標寄生蟲（卵），以及是否存在2種及以上的寄生蟲（卵），最后還會將考核寄生蟲的形態、生活史等相關資料，以及上報結果中出現的相似寄生蟲（卵）的鑒別要點及難點進行詳細說明。所以我們可以從12份未評分樣本回報資料中各參評實驗室的上報情況看出，對大多數實驗室而言，難點都是相似的，即原蟲的識別以及一些少見蟲卵的鑒別。通過對未評分樣本中考核的易漏檢且較難辨認的原蟲進行復習、比較和濕片查找，本實驗室總結了它們各自的形態特征（表4、圖4）。其中人芽囊原蟲近年來在本實驗室的檢出率越來越高，該寄生蟲是一種呈世界性分布，且動物宿主廣泛的人獸共患寄生原蟲，屬于機會致病病原體，其感染率在不同國家和地區間差異顯著[4]，除南極洲以外的各大洲均有人芽囊原蟲流行的相關報道[5]。盡管對于人芽囊原蟲的致病性尚存在一定爭議，但隨著近年來人類對人芽囊原蟲認識的深入，越來越多的證據表明，人芽囊原蟲與人類多種疾病密切相關，其中胃腸道疾病最常見[6]，臨床癥狀以腹痛、腹瀉最多[11]，并且人芽囊原蟲感染還可能是蕁麻疹和皮膚病的一個重要病因[7-8]。這些研究結果表明，人芽囊原蟲具有潛在致病性。因此，正確識別人芽囊原蟲對相關疾病的治療非常重要。

圖4 未評分樣本中易漏檢且較難辨認原蟲（碘染色，×400）（圖片來源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html）

從樣本2015 P3-13的參評實驗室上報結果可以看出，上報結果為考核目標的縮小膜殼絳蟲卵的比例比上報結果為微小膜殼絳蟲卵的低。這2種蟲卵在臨床工作中均比較少見，在鑒別上存在一定困難，特別是當標本不新鮮時，會增加識別難度。2種蟲卵的鑒別要點在于：縮小膜殼絳蟲卵卵殼較厚，胚膜兩端無極絲，卵殼與胚膜間有輻射狀條紋；微小膜殼絳蟲卵卵殼較薄，卵殼與胚膜間無輻射狀條紋，胚膜兩端凸起，有2～4對極絲（圖5）。

圖5 縮小膜殼絳蟲卵與微小膜殼絳蟲卵（0.9% NaCl溶液涂片，×400）

EQA（特別是臨檢中心EQA）中考核的蛔蟲卵與鉤蟲卵形態多樣，我們在日常檢測中也會遇到。如脫蛋白質膜的受精蛔蟲卵和退變鉤蟲卵，由于與典型蟲卵在形態上存在一定差異而容易誤認。脫蛋白質膜受精蛔蟲卵的特點是：卵殼厚，呈雙線層，卵殼和卵細胞之間可見新月形空隙。退變鉤蟲卵的特點是：卵殼薄、卵細胞融合為1團，體積變小，卵殼和卵細胞之間空隙更加明顯。另外，如果患者便秘，或糞便放置過久，鉤蟲卵內細胞分裂為多細胞期，則與東方毛圓線蟲卵形態相似，東方毛圓線蟲卵比鉤蟲卵稍大，為長圓形，長一般為寬的2倍以上，一端較尖，卵內細胞為10～20個（圖6）。蛔蟲卵和鉤蟲卵是臨床上常見的蟲卵，因此它們的各種形態的辨認都非常重要。

圖6 鉤蟲卵與蛔蟲卵、東方毛圓線蟲卵（0.9% NaCl涂片，×400）[（b）圖片來源于臨檢中心；（c）、（d）圖片來源于https：//www.cdc.gov/dpdx/az.html]

對于糞便樣本，除需要辨認各種相似蟲卵外，還存在各種食物殘渣，形態各異，有的看上去與某些寄生蟲（卵）相似，容易誤認。如華支睪吸蟲卵和靈芝孢子在形態上非常相似，兩者的鑒別要點是：華支睪吸蟲卵比靈芝孢子大，呈淡黃褐色，在低倍鏡下形似芝麻，高倍鏡下可見明顯的卵蓋、肩峰、小疣、內含毛蚴；而靈芝孢子呈棕色，且不具備這些結構（圖7）。含有靈芝孢子的糞便樣本通常呈棕褐色，并且就診者均曾服用過靈芝孢子類藥物或保健品。因華支睪吸蟲感染與膽結石、膽囊炎等肝膽系統并發癥密切相關，且是明確的膽管癌致癌物[9-12]，故正確識別華支睪吸蟲卵對臨床治療意義重大。鉤蟲卵與豌豆花粉顆粒形態相似；不完整的帶絳蟲卵與十字花科油菜花粉顆粒形態相似；蟯蟲卵與薔薇科雪花梨花粉顆粒相似；受精蛔蟲卵與菊科植物刺兒菜花粉顆粒以及豆科菜豆花粉顆粒形態上均相似，極易混淆而致誤認，均應仔細識別[13]。

圖7 華支睪吸蟲卵與靈芝孢子（圖片來源于臨檢中心）

要減少和避免EQA樣本與臨床糞便樣本寄生蟲（卵）的漏檢及誤診，除涂片厚薄適中外，還需要增加檢測視野，對于高度懷疑寄生蟲感染的樣本需要通看全片，必要時可采用濃集法檢測。另外，還需要檢驗人員多在顯微鏡下觀察各種寄生蟲（卵），充分掌握其形態特點。本實驗室將查見寄生蟲（卵）的EQA樣本制作成混合蟲卵樣本，與EQA圖片和圖譜一起，供日常鏡下形態識別、學習和考核比對，以進一步提高寄生蟲形態學檢驗能力。

通過對寄生蟲形態學EQA資料階段性的回顧分析，不僅可以了解過去8年本實驗室在EQA中出現的錯誤和出現該類錯誤的頻率，還可以作為以后某一階段回顧性分析的參考資料。通過參加寄生蟲EQA活動，使糞便常規中寄生蟲檢驗的質量得到了提高，檢驗人員檢出和識別寄生蟲的能力也得到了提升。