不同增強劑對熒光PCR中尿素、血紅素和膽酸鹽抑制作用消除效果研究

劉文霞，王 瑋，林松洋，李振紅

（鄭州安圖生物工程股份有限公司研發中心，河南 鄭州 450016）

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）目前已被廣泛應用于臨床診斷等領域，成為醫學診療活動中不可缺少的技術[1]。然而，當這項技術應用于臨床檢驗中的血液、糞便等復雜生物樣本時，PCR抑制物成為結果判讀的障礙。PCR抑制物通常來源于樣本本身，或來源于收集、處理樣本的過程，會顯著降低PCR的靈敏度和擴增效率，對檢測結果造成干擾，降低結果的準確性。針對PCR抑制物的干擾，添加劑成為解決此問題的有效方法。學者們已發現了越來越多的PCR增強劑，可在不同方面對PCR起促進作用，如提高PCR的特異性、增加PCR擴增的產量及防止無效擴增等[2-3]。在臨床檢驗中，血液中的血紅素、尿液中的尿素、糞便中的膽酸鹽均對PCR有抑制作用[4]。為此，本研究擬探討13種PCR增強劑對臨床檢驗中常見的PCR抑制物尿素、膽酸鹽和血紅素抑制作用的消除效果，以期降低臨床PCR檢測假陰性結果的概率，提高臨床檢測準確性。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

從全血樣本中提取人基因組DNA后純化，-20 ℃保存。核酸提取或純化試劑、全血樣本處理試劑及人β珠蛋白基因擴增試劑均購自鄭州安圖生物股份有限公司。血紅素購自國藥集團化學試劑有限公司。膽酸鹽、尿素、亞精胺、甲酰胺、PEG6000、Tween-20、甜菜堿、海藻糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、明膠、硫酸銨、四甲基氯化銨（tetramethylammonium chloride，TMAC）、甘油、Triton X-100購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。Nonidet P 40（NP40）購自湖北佰智昂生物化工有限公司。MILLI-Qreference超純水機購自默克化工技術（上海）有限公司。AL204電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA制備 按試劑說明書進行全血樣本前處理及人基因組DNA模板的提取和純化。

1.2.2 熒光PCR擴增體系構建 以提取的人基因組DNA作為模板，擴增β珠蛋白基因中的一段序列，上游引物為5'-GAAGGCTCATGGCAAGAAAG-3'，下游引物為5'-CTCACTCAGTGTGGCAAAGG-3'，探針序列為CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAG-CY5。本研究構建了3種熒光PCR擴增體系，具體信息見表1。將構建好的擴增體系在ABI7500實時熒光定量PCR儀上進行擴增，反應條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃22 s，45個循環。擴增完成后；如空白對照組擴增曲線為標準S型曲線，循環閾值（cycle threshold，Ct）為29±1，則本次擴增有效。

表1 3種熒光PCR擴增體系構建信息 μL

1.2.3 抑制物和增強劑的配制 根據預實驗結果，使用超純水配制不同濃度膽酸鹽（4.65、6.98 mmol/L）、尿素（0.91、0.99 mol/L）、血紅素（6.40、6.98 mmol/L）作為抑制物。使用超純水配制不同濃度亞精胺（0.16～60.00 mmol/L）、甲酰胺（2.5%～40.0%）、PEG6000（2.5%～40.0%）、NP40（0.6%～10.0%）、Tween-20（2.5%～40.0%）、甜菜堿（0.1～5.0 mol/L）、海藻糖（0.125～1.500 mol/L）、BSA（30～376 mmol/L）、明膠（0.125%～2.000%）、硫酸銨（6.25～100.00 mmol/L）、TMAC（12.5～200.0 mmol/L）、甘油（20%～60%）、Triton X-100（1.25%～20.00%）作為增強劑。所有試劑均置于2～8 ℃儲存備用。

1.3 抑制物抑制作用和增強劑抗抑制作用的判定

1.3.1 抑制作用的判定 以PCR中無抑制物的擴增結果作為對照，逐步增加抑制物濃度。當含抑制物的樣本Ct值較對照增大1時，判定為擴增受抑制，將無擴增曲線、擴增結果為“無Ct值”（Ct=0）時的最小抑制物濃度確定為抑制物的工作濃度。含抑制物的樣本占對照樣本擴增平臺期熒光強度的百分比=含抑制物的樣本擴增平臺期熒光強度/對照樣本擴增平臺期熒光強度×100%，其中擴增平臺期熒光強度可從ABI 7500實時熒光定量PCR儀上的該次實驗擴增曲線圖中讀出。如含抑制物樣本的Ct值與對照樣本相同，但百分比低于對照樣本，說明抑制作用仍存在。

1.3.2 抗抑制作用的判定 在模板DNA中分別加入工作濃度的抑制物和5 μL不同濃度的13種增強劑，以不加入增強劑且含有相應工作濃度抑制物的樣本作為對照。以與對照樣本相比擴增曲線平臺期的熒光強度顯著提高、由無Ct值變為有Ct值或Ct值高于對照樣本為標準（對照樣本無擴增曲線），判斷增強劑對膽酸鹽、尿素和血紅素的抗抑制作用。

2 結果

2.1 抑制物工作濃度確認

膽酸鹽、尿素和血紅素的工作濃度分別為6.98 mmol/L、0.99 mol/L、6.98 mmol/L。見表2。

表2 抑制物工作濃度的確認

2.2 增強劑對PCR抑制物的影響

6.5 mmol/L亞精胺、20%甘油可消除6.98 mmol/L膽酸鹽對PCR的抑制作用，6.5 mmol/L亞精胺、100 mmol/L硫酸銨、0.2 mol/L甜菜堿可消除0.99 mol/L尿素對PCR的抑制作用。300 mmol/L BSA、6.5 mmol/L亞精胺、20%PEG6000、50%甘油可消除6.98 mmol/L血紅素對PCR的抑制作用。40%甲酰胺、10%NP40、40% Tween-20、1.5 mol/L海藻糖、2%明膠、200 mmol/L TMAC和20% Triton X-100均無法降低6.98 mmol/L膽酸鹽、0.99 mol/L尿素和6.98 mmol/L血紅素對PCR的抑制作用。見表3。

表3 不同濃度增強劑抗膽酸鹽、尿素和血紅素抑制作用

3 討論

理論上，PCR可以檢測單個細胞或DNA分子。然而，PCR抑制物的存在影響了PCR的擴增效率，從而降低了PCR的檢測能力，降低了檢測靈敏度。增強劑是解決PCR抑制問題的有效方法。目前已有多種PCR增強劑被開發出來[5]。

本研究結果顯示，亞精胺表現出顯著的抗膽酸鹽、尿素和血紅素抑制的效果。WAN等[6]的研究結果顯示，亞精胺對PCR有增強作用，其原理是小分子亞精胺通過促進聚合酶、引物和模板的結合來促進 PCR起始復合物的形成，微摩爾濃度的亞精胺可顯著增強植物基因組DNA的擴增。海藻糖、BSA和Tween-20對蝦殼成分有抗抑制作用，因此常被用于檢測蝦樣本中病毒的PCR方法中[7]。此外，BSA可以提高rTth酶對生物樣本的抗性，且BSA中的賴氨酸含量高，可結合核酸提取過程中殘留的酚類化合物，保護TaqDNA聚合酶活性，從而起到增強PCR擴增效率的作用[8]。甜菜堿具有破壞富含GC的DNA序列的能力，可提高PCR擴增的產量和特異性。在中藥材鑒定中，硫酸銨可以優化引物與模板的特異性結合，提高PCR的特異性。本研究結果顯示，硫酸銨具有顯著的抗尿素抑制作用。有研究結果顯示，PEG600和甘油可通過增強酶的熱穩定性及保護酶活性來提高PCR產物的產量[9]。本研究結果顯示，甘油和PEG6000對不同抑制物表現出了不同的增強作用，甘油對膽酸鹽有顯著的抗抑制作用，而PEG6000對尿素和血紅素有顯著的抗抑制作用，這可能與抑制物自身的性質有關，不同抑制物抑制PCR的機制有一定差異。

綜上所述，本研究所選的3種抑制物（膽酸鹽、尿素和血紅素）在臨床檢測中較為常見，即使樣本經過某些前處理，仍不可避免地會有抑制物殘留。通過對PCR增強劑的篩選，可以為PCR抑制問題提供一個可行的研究方向和解決方法，提高熒光PCR的檢測靈敏度。