河南地區(qū)少見CRE耐藥性分析及碳青霉烯酶初篩實(shí)驗(yàn)的臨床應(yīng)用

孫 英，李 軼，閆文娟，荊 楠，馬 冰

（河南省直第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000）

近年來(lái)，極具耐藥性的革蘭陰性細(xì)菌，尤其是碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE）的檢出率日益增高[1]。2018年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，河南地區(qū)CRE檢出率居首位[2]。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE最重要的耐藥機(jī)制[3]。本研究回顧性分析河南省直第三人民醫(yī)院2019年少見CRE的臨床檢出和耐藥情況，并分析CRE產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶的情況，為CRE院內(nèi)防控及精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019年分離自河南省直第三人民醫(yī)院臨床樣本的非重復(fù)少見CRE，從中隨機(jī)選取22株亞胺培南和/或美羅培南耐藥[最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 μg/mL]株。

1.2 儀器和試劑

美國(guó)BD公司Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)、英國(guó)OXIOD公司藥物敏感性試驗(yàn)紙片，鄭州安圖生物科技有限公司血瓊脂平板和M-H平板，珠海迪爾生物有限公司酶抑制劑法緩沖液試劑，NG-TEST CARBA 5膠體金試劑盒（長(zhǎng)沙中生眾捷公司），MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀（德國(guó)布魯克公司）。

1.3 質(zhì)控菌株

銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和大腸埃希菌（ATCC 25922）為體外藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌株；肺炎克雷伯菌（ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706、ATCC BAA 2146）為碳青霉烯酶初篩實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株，由河南省人民醫(yī)院閆文娟博士惠贈(zèng)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及體外藥物敏感性試驗(yàn) 按照第3版《臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作》[4]要求進(jìn)行樣本采集及細(xì)菌培養(yǎng)，采用 Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)，同時(shí)采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行補(bǔ)充體外藥物敏感性試驗(yàn)，參照2018年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S28文件[5]進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.4.2 碳青霉烯酶酶型初篩實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取22株除肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌外的CRE臨床分離株，采用MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種復(fù)核，采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）聯(lián)合3-氨基苯硼酸（3-aminophenylboric acid，APBA）碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)和膠體金免疫層析法篩查菌株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶的酶型[6]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WHONET 5.6和EXCEL 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 CRE檢出情況

2019年河南省直第三人民醫(yī)院共檢出1 111株CRE，其中陰溝腸桿菌49株（15.4%）、產(chǎn)酸克雷伯菌14株（19.2%）、枸櫞酸桿菌屬12株（13.8%）。見表1。

表1 CRE菌種分布及構(gòu)成比

2.2 CRE耐藥性分析

CRE對(duì)多種臨床常用抗菌藥物有較高的耐藥率，不同菌屬對(duì)不同抗菌藥物的耐藥性存在差異。CRE對(duì)亞胺培南的耐藥率高于美羅培南；未檢出對(duì)替加環(huán)素、多黏菌素B耐藥腸桿菌屬、產(chǎn)酸克雷伯菌、枸櫞酸桿菌屬，對(duì)多黏菌素B及替加環(huán)素天然耐藥的變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬對(duì)氨曲南的耐藥率分別為5.3%和14.3%。不同菌屬CRE對(duì)抗菌藥物的耐藥率見表2。

表2 CRE對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率 %

2.3 碳青霉烯酶初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從1 111株CRE中隨機(jī)選取22株，同時(shí)采用EDTA聯(lián)合APBA碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)和膠體金免疫層析法篩查菌株所產(chǎn)酶的酶型。結(jié)果顯示，有13株EDTA碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性即產(chǎn)金屬酶，膠體金免疫層析法結(jié)果顯示其酶型為NDM；4株APBA碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性即產(chǎn)絲氨酸酶，其中3株膠體金免疫層析法結(jié)果顯示其酶型為KPC，1株陰性；2株EDTA+APBA碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性即產(chǎn)金屬酶+絲氨酸酶，膠體金免疫層析法結(jié)果顯示其酶型分別為KPC+IMP+NDM、KPC+NDM；3株碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)未檢出，其中1株膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果顯示酶型為OXA。部分結(jié)果見圖1。

圖1 部分碳青霉烯酶初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，由于抗菌藥物的不合理使用，CRE日益增多，其對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥情況也日趨嚴(yán)重，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)，分析細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性和碳青霉烯酶酶型是解決臨床治療CRE困境的重要途徑[7]。本研究結(jié)果顯示，檢出的1 111株CRE中，肺炎克雷伯菌所占比例最高（51.8%），其他腸桿菌科如陰溝腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、枸櫞酸桿菌屬、普羅威登斯菌屬中亦不斷有CRE菌株檢出，應(yīng)引起臨床重視。本研究結(jié)果顯示，CRE對(duì)多種臨床常用抗菌藥物有較高的耐藥率，且腸桿菌科細(xì)菌不同菌屬對(duì)不同抗菌藥物的耐藥性存在差異；CRE對(duì)亞胺培南耐藥率高于美羅培南，腸桿菌屬、產(chǎn)酸克雷伯菌、枸櫞酸桿菌屬對(duì)替加環(huán)素、多黏菌素B均敏感。雖然CLSI提示普羅威登斯菌屬可能因存在非產(chǎn)碳青霉烯酶機(jī)制而導(dǎo)致亞胺培南MIC升高，但是臨床檢出菌株中美羅培南耐藥普羅威登斯菌屬CRE亦不斷出現(xiàn)。本研究中，對(duì)多黏菌素B和替加環(huán)素天然耐藥的變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬對(duì)氨曲南也有較低的耐藥率，分別是5.3%和14.3%?？赡芘c其易產(chǎn)金屬酶而能被氨曲南抑制有關(guān)[7]。

腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要為產(chǎn)碳青霉烯酶、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶或頭孢菌素酶伴外膜蛋白缺失、外排泵系統(tǒng)上調(diào)等，其中最重要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶。根據(jù)耐藥機(jī)制研究和流行病學(xué)分析結(jié)果可知，我國(guó)CRE的主要流行株為產(chǎn)KPC型肺炎克雷伯菌，大腸埃希菌主要流行株為NDM型[8]，有關(guān)其他菌株的研究數(shù)據(jù)相對(duì)較少，酶型篩查大多采用CLSI推薦的改良碳青霉烯類失活法（modified carbapenem inactivation method，mCIM）或聯(lián)合乙二胺四乙酸-碳青霉烯類失活法（ethylenediaminetetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM）[9]，耗時(shí)較長(zhǎng)。本研究隨機(jī)選取22株除肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌外的少見CRE臨床分離株，采用聯(lián)合EDTA和APB碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)，同步進(jìn)行膠體金免疫層析法菌株酶型篩查，結(jié)果顯示，EDTA碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性即產(chǎn)金屬酶13株，膠體金免疫層析法檢測(cè)酶型均為NDM；APBA碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性即產(chǎn)絲氨酸酶4株，膠體金免疫層析法檢測(cè)3株酶型為KPC，1株陰性，推測(cè)可能產(chǎn)KPC和OXA外的其他絲氨酸酶；EDTA+APBA碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性即產(chǎn)金屬酶+絲氨酸酶2株，膠體金免疫層析法檢測(cè)酶型分別為KPC+IMP+NDM和KPC+NDM；碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)未檢出3株，其中1株膠體金免疫層析法檢測(cè)酶型為OXA，2株膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果為陰性的菌株可能是由非產(chǎn)酶機(jī)制引起的碳青霉烯類耐藥。有研究結(jié)果表明，CRE菌株中，除肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌外，其他腸桿菌科細(xì)菌酶型主要為NDM型金屬酶，該酶型對(duì)頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥率較高[10]。

對(duì)CRE酶型進(jìn)行分析能對(duì)臨床CRE精準(zhǔn)治療提供用藥參考，因此碳青霉烯酶檢測(cè)具有很好的臨床價(jià)值。目前，檢測(cè)碳青霉烯酶的金標(biāo)準(zhǔn)是聚合酶鏈反應(yīng)，操作都較為繁瑣，需要特殊的試劑和儀器，且對(duì)操作人員有較高的要求，在大多臨床微生物實(shí)驗(yàn)室無(wú)法常規(guī)開展。EDTA聯(lián)合APBA碳青霉烯酶抑制實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易于判讀；膠體金免疫層析法方便快捷，大大縮短了報(bào)告時(shí)間，可盡早為臨床用藥提供參考。

綜上所述，CRE檢出率及耐藥率高是河南地區(qū)臨床抗菌藥物使用所面臨的棘手問(wèn)題，少見CRE的耐藥性及其多樣的酶型更增加了臨床治療的困難。CRE的耐藥性和碳青霉烯酶酶型檢測(cè)有著廣泛的臨床意義，本研究后續(xù)將進(jìn)一步增加酶型檢測(cè)數(shù)量，并觀察臨床病例感染與治療情況，以期為CRE臨床診治和感染控制提供更精準(zhǔn)、快捷的參考。