四川地區養豬場豬細小病毒病的病原檢測及遺傳進化分析

徐富權 蔣運剛 黃朝沖

（四川省資陽市雁江區小院鎮畜牧獸醫站，四川資陽 641316）

豬細小病毒病（Porcine parvovirus disease）是由豬細小病毒（Porcine parvovirus,PPV）感染引起的一種生殖障礙疾病，PPV可以感染任何年齡段的母豬，但妊娠母豬的癥狀最為明顯，表現為母豬流產，產下木乃伊胎、病弱胎、畸形胎；感染該病毒后母豬表現再懷孕困難、發情不穩定，仔豬感染后引起皮炎和腹瀉[1]。繁殖障礙的嚴重程度取決于毒株的致病性和母豬所處的妊娠期。一般在母豬妊娠30 d內感染，主要導致胚胎死亡或被母體重吸收；母豬妊娠30～70 d感染，主要表現為流產、產死胎、木乃伊胎；母豬妊娠70 d后感染，一般不引起病害，母豬多能正常產仔，但所產仔豬常常帶有抗體并長期帶毒[2]。PPV經常與豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）等的1種或幾種形成混合感染[3]，給生豬養殖業帶來巨大損失。

豬細小病毒為DNA病毒，在分類上為細小病毒科細小病毒屬。豬細小病毒的外觀具有多形性，一般呈對稱的20面體結構，六角形或圓球形[4]。病毒粒子直徑約為20 nm，粒子表面沒有囊膜，相對分子量為1.4×106[5]。豬細小病毒有2個ORF[6]，其主要編碼3個結構蛋白，主要參與病毒基因組的復制、轉錄等[7]。豬細小病毒在原代和傳代細胞中均可以很好地增殖，并可使正常細胞產生病變[8]。豬細小病毒只有1種血清型[9]，不具有很強的變異能力。豬細小病毒對外界環境極不敏感，對熱不敏感，給予豬細小病毒70℃處理2 h，豬細小病毒仍然可以進行感染[10]。對一般的消毒劑、紫外線、酸性環境抵抗力很強。

目前為止，全球共發現7種基因型的PPV，PPV1是最早于法國發現的經典基因型，從污染的細胞中分離獲得[11]，PPV1是被公認的最常見的基因型，也是造成損失最嚴重的基因型，目前已在美國、韓國、巴西等國家廣泛分布，在我國的湖南、吉林、安徽、廣西、山東、福建等地廣泛流行。PPV2～PPV6通過宏基因組測序等檢測技術陸續被發現[12]。新型細小病毒PPV7是Palinski于2016年利用宏基因組測序在美國健康成年豬的直腸拭子中首次發現的，經鑒定認為是一種新的基因型[13]。本文通過PCR技術對四川地區豬的流產胎兒、死胎等樣品進行檢測、鑒定，對豬細小病毒病在四川地區的流行進行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

采集2020—2021年四川地區具有流產情況的豬場樣品，樣品類型為流產胎兒或胎兒組織、木乃伊胎、畸形胎或畸形胎組織、流產胎衣等，用干凈的收集管收集，做好標記，記錄樣品來源及時間，運輸時用冰袋維持低溫環境，帶回實驗室-20℃保存備用。

1.2 主要試劑

本試驗主要試劑DL 2 000 Marker、GreenView核酸染料、2×Taq PCR Master Mix購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 引物名稱與序列

參考中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準《豬細小病毒病檢疫技術規范》 （SN/T 1919—2016）中豬細小病毒1型特異性上下游引物序列，由上海生工生物工程技術公司合成引物。

1.4 樣品組織處理及DNA提取

準備組織剪、鑷子、研缽，利用酒精棉球將器具及周圍環境進行灼燒滅菌，待其冷卻至室溫后，用鑷子小心夾出待測組織，用組織剪剪取組織中心未被污染的區域置于研缽中，于-70℃冰箱凍存5 min，5 min后取出快速研磨，研磨后繼續凍存3 min，取出后繼續研磨，至無明顯組織團塊，加入1 mL生理鹽水研磨均勻，轉移至無菌離心管中，8 000 rpm離心2 min，取上清液進行DNA提取[14]。提取的DNA置于-20℃備用。

表1 PCR檢測引物

1.5 PCR檢測

PCR反應體系為 20 μL，2×PCR Master mix10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補足至20μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，共35個循環；72℃延伸10 min。反應結束后取5 μL擴增產物于1%含核酸染料的瓊脂糖凝膠中。電泳后，用凝膠成像分析系統觀察拍照，記錄檢測結果。

1.6 數據處理

根據GenBank收錄的不同PPV1毒株的VP2基因序列，使用DNAstar生物學軟件Megalign方法進行序列同源性分析，并通過MEGA6鄰接法構建系統進化樹進行遺傳進化分析。

表2 PPV參考序列

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

將樣品用VP2基因設計的特異性引物進行擴增，擴增產物用1%瓊脂糖進行電泳，結果見圖1，PCR結果顯示20份樣品中有7份樣品為PPV1陽性，擴增出445 bp的特異性片段，符合預期。

圖1 豬細小病毒VP2基因擴增凝膠成像圖

2.2 測序及序列分析

將擴增得到的目的條帶送至成都有康生物科技有限公司測序后通過NCBI進行Blast比對，比對發現，該病毒序列與GenBank中的韓國毒株KF9（登錄號：MH447550.1）VP2基因同源性為96%。

在NCBI上下載PPV1不同株的VP2基因片段序列，利用鄰接法構建系統進化樹。系統進化分析結果顯示，目的序列與吉林長春毒株DJH24（登錄號：MK0923 84）、湖南毒株HuN 1（登錄號：MH183298）聚為一支（圖2），核苷酸序列之間一致性為96.56%。

圖2 豬細小病毒VP2基因部分序列的系統樹

3 討論

豬細小病毒對妊娠母豬產生的危害較大，母豬一旦感染，將會影響整胎仔豬的質量。豬細小病毒病的主要傳染源是帶毒的公豬和母豬，病毒能通過胎盤垂直傳播，檢測時除了采集死胎、病弱胎、木乃伊胎的組織，還可以采集臍帶血液、胎衣、母豬的陰道分泌物、子宮排泄物等。種公豬也是危險的傳染源，病毒可以在公豬的精液、精索、附睪、性腺中復制[15]，公豬的精液采集之后，應該先進行細小病毒的篩查，檢測結果為陰性后方可給母豬授精。初產母豬比經產母豬更容易感染，因此，在初產母豬授精、妊娠階段更應該做好細小病毒的防護隔離，做好疫苗注射計劃。有條件的養豬場還應該進行豬細小病毒抗體水平的檢測。

從生物安全角度來講，豬細小病毒的凈化比疫苗注射更有效、更重要。但因豬細小病毒抵抗力較強，因此，要想使一個無感染的豬場保持下去，必需采取嚴格的衛生措施。盡量堅持自繁自養，如必須引進種豬，應從無疫情豬場引進[16]，且引進前需進行豬細小病毒的篩查，引進后進行必要的隔離。妥善處理感染母豬產下的死胎、病弱胎、木乃伊胎及胎衣，對污染的尸體、污物、場地進行嚴格的消毒，做好無害化處理工作[17]。

疫苗預防是公認的預防豬細小病毒病、提高母豬抵抗力和繁殖率的有效方法[18]。養豬場做好生物安全的同時，也應該做好疫苗免疫計劃，妊娠母豬應嚴格按照疫苗免疫計劃進行疫苗注射。豬細小病毒疫苗有活疫苗和滅活疫苗[19]。活疫苗產生的抗體滴度高，維持時間長；滅活疫苗維持時間較短，一般只有半年，可在配種前幾周進行免疫[20]。免疫后應測定抗體效價，抗體效價高于1∶80時，即可抵抗豬細小病毒感染[21]。無論是初產母豬，還是經產母豬，每次配種前都應進行免疫注射。謹慎選擇疫苗，如果疫苗使用不當會造成人為傳入病情，最好使用滅活疫苗。延遲分娩的母豬應該使用前列腺烯醇及時引產，防止胎兒在子宮中腐敗滯留，腐蝕子宮膜，引起子宮內膜炎，導致母豬下次配種不易受孕[22]。

從本試驗的檢測結果來看，近段時間，四川地區的養豬場感染豬細小病毒的情況較為嚴重，在抽樣調查的20份病樣中，有7份病樣是豬細小病毒陽性，在抽樣調查的病樣中豬細小病毒感染率為35%。此病發病率呈現升高趨勢的原因可能與未曾免疫或免疫程序不科學，引種不慎有關。為此，四川省各個豬場應加強豬細小病毒病的引種檢疫及免疫工作，實施科學的免疫程序。

4 小結

綜上所述，四川地區豬細小病毒陽性毒株與湖南地區的HuN 1毒株和吉林長春的DJH24毒株有高度的同源性，證明此毒株在中國西南、中部、東北地區廣泛傳播，且并未進行較大程度的變異。