豬瘟活疫苗效力檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

陳建凱 張 璞 齊冬梅 賴(lài)月輝 侯高偉 周曉敏 吳浩平 曾垠濤

（1佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528225；2廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州 510530）

豬瘟（Classical swine fever,CSFV）又稱(chēng)為古典豬瘟，早期被養(yǎng)豬界稱(chēng)為豬霍亂（Hog cholera,HC）。該病是由家豬或野豬感染豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）后發(fā)生豬群相互傳播的疾病，也是流行范圍非常廣的一種動(dòng)物傳染病，該病曾在世界上許多國(guó)家和地區(qū)廣泛流行和傳播。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）也將其列為A類(lèi)16種法定傳染病之一。豬瘟是給我國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的一種非常嚴(yán)重的傳染病，我國(guó)一直非常注重豬瘟的防控，《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》將豬瘟列為一類(lèi)傳染病。仔豬通常更易感染此病，免疫功能不全的發(fā)病癥狀更嚴(yán)重，患病豬一般表現(xiàn)為發(fā)熱、出血，體溫升高至41℃，有的患病豬體溫甚至達(dá)到了42.2℃，而且高熱稽留，癥狀維持?jǐn)?shù)天。該病常常造成養(yǎng)豬場(chǎng)的豬只大批死亡，死亡率高達(dá)80%～90%。目前，疫苗免疫仍是預(yù)防豬瘟蔓延的有效手段，豬瘟疫苗的效價(jià)是否合格也是免疫成敗的關(guān)鍵因素。現(xiàn)通過(guò)介紹豬瘟活疫苗的效力檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，為檢測(cè)豬瘟疫苗，確保豬瘟疫苗產(chǎn)品穩(wěn)定性提供參考。

1 豬瘟病毒和豬瘟活疫苗簡(jiǎn)介

按照國(guó)際學(xué)術(shù)界對(duì)豬瘟病毒的認(rèn)知，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（ICTV）將CSFV劃分屬于黃病毒科，瘟病毒屬，并且與之同屬的病毒還有牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）和邊界病毒（Border disease virus,BDV）。CSFV是一種包裹囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]，該病毒的基因組全長(zhǎng)是12.3 kb，含有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框，并且具有高度保守的5’和3’端非編碼區(qū)，該病毒的閱讀框是負(fù)責(zé)編碼3 898個(gè)氨基酸的多聚蛋白，這種多聚蛋白在細(xì)胞蛋白酶和病毒特異性蛋白酶的作用下，產(chǎn)生裂解，裂解以后，產(chǎn)生4個(gè)該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、E1、E2）和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 （Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B），尤其是E2蛋白，此蛋白是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的主要免疫原，在設(shè)計(jì)能區(qū)分感染與接種動(dòng)物（Differentiability of infected fron vaccinated animals，DIVA）的疫苗上被廣泛應(yīng)用。該病毒粒子的直徑為40～50 nm，呈球形，有二十面體對(duì)稱(chēng)的核衣殼，病毒粒子具有脂蛋白囊膜，囊膜表面上有6～8 nm的纖突，浮密度為1.15～1.16 g/mL，等電點(diǎn)4.8，沉降系數(shù)為140～180 S。電子顯微鏡下觀(guān)察可以看到病毒粒子表面不規(guī)則的纖突結(jié)構(gòu)。CSFV的存活力比較強(qiáng)，能夠在50℃環(huán)境中存活3 d，37℃環(huán)境中可存活7 d。CSFV能在豬原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞上復(fù)制、繁殖，但不引起細(xì)胞病變（CPE）。

CSFV只有一個(gè)血清型，但分離到不少變異毒株。當(dāng)前我國(guó)使用最廣泛的是豬瘟兔化弱毒疫苗。1954年，我國(guó)科學(xué)家周泰沖等成功研制出豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV），并被世界許多國(guó)家使用，普遍反映我國(guó)研制的豬瘟兔化弱毒疫苗效果較好。該疫苗的毒株被國(guó)際上公認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)弱毒株，稱(chēng)為中國(guó)疫苗株（C株）。2008年，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所寧宜寶等聯(lián)合廣東永順生物制藥股份有限公司成功研制出豬瘟兔化弱毒傳代細(xì)胞疫苗，疫苗效價(jià)高、免疫原性好、對(duì)豬的保護(hù)力強(qiáng)，而且采用豬睪丸細(xì)胞（ST）培養(yǎng)，降低了用牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)可能造成BVDV污染的風(fēng)險(xiǎn)，該豬瘟疫苗的問(wèn)世為我國(guó)乃至世界豬瘟防控做出了新的貢獻(xiàn)。

2 豬瘟活疫苗效力檢測(cè)方法

2.1 兔體定型熱反應(yīng)檢測(cè)法

該方法是現(xiàn)行的《中華人民共和國(guó)獸藥典》[2]中明確的豬瘟活疫苗檢測(cè)的方法。兔體定型熱反應(yīng)檢測(cè)法從20世紀(jì)50年代建立并沿用至今，也是目前我國(guó)使用最為經(jīng)典的豬瘟活疫苗檢測(cè)方法。每批豬瘟活疫苗經(jīng)稀釋后接種健康的新西蘭大耳白兔，每只兔經(jīng)耳緣靜脈注射1 mL，然后每隔6 h進(jìn)行體溫測(cè)定，繪制體溫曲線(xiàn)，計(jì)算出每頭份RID含量。該方法比在豬活體免疫攻毒的方法簡(jiǎn)單，但仍受到兔子個(gè)體差異、飼養(yǎng)環(huán)境、接種應(yīng)激等方面的影響，導(dǎo)致檢測(cè)成本比較高，檢測(cè)試驗(yàn)周期性較長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性較差，可重復(fù)性較差。因此，該方法檢測(cè)豬瘟活疫苗的弊端也日益顯現(xiàn)，隨著時(shí)代的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，將會(huì)有新的檢測(cè)方法補(bǔ)充或替代。

2.2 ELISA檢測(cè)法

ELISA檢測(cè)法是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測(cè)豬瘟病毒的最常用方法。也可用于規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)豬瘟抗體的監(jiān)測(cè)。對(duì)豬瘟活疫苗系列稀釋后接種豬睪丸細(xì)胞（ST）所收獲的待檢樣品，采用抗原捕獲ELISA檢測(cè)試劑盒，樣品中的豬瘟疫苗弱毒抗原被捕獲，捕獲的豬瘟疫苗弱毒抗原由瘟病毒特異性抗體（Erns）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)。未結(jié)合的酶標(biāo)記物被洗掉，再加入底物和色原體溶液。在酶的存在下，底物轉(zhuǎn)化為可以與色原體發(fā)生反應(yīng)的產(chǎn)物。采用ELISA方法進(jìn)行豬瘟活疫苗效力檢測(cè)。ELISA檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)是不需要提取豬瘟病毒RNA，操作簡(jiǎn)單，而且該方法具有較高的敏感性和特異性。但是試劑盒的價(jià)格比較高。而且疫苗接種ST細(xì)胞后，第一次收獲病毒液效價(jià)不穩(wěn)定，二收、三收的病毒效價(jià)比較穩(wěn)定。王海光等[3]采用抗原捕獲ELISA法檢測(cè)不同稀釋濃度的豬瘟活疫苗中活病毒感染細(xì)胞后增殖出的子代病毒量，通過(guò)計(jì)算豬瘟活疫苗病毒的最高細(xì)胞感染劑量，建立豬瘟活疫苗效力檢測(cè)方法。

2.3 間接免疫熒光法 （IFA）

CSFV在敏感性細(xì)胞（如ST細(xì)胞、PK細(xì)胞等）內(nèi)生長(zhǎng)不會(huì)引起細(xì)胞病變，顯微鏡下觀(guān)察組織切片也不能看到明顯的病變。因此可以采用間接免疫熒光（IFA）的方法檢測(cè)豬瘟疫苗毒。間接免疫熒光法是采用一種抗原的抗體（或者稱(chēng)之為一抗），然后進(jìn)行細(xì)胞孵育的時(shí)候發(fā)生結(jié)合，并且能夠與對(duì)應(yīng)一抗（或者稱(chēng)之為抗一抗）的抗體（可稱(chēng)為二抗，二抗上具有能夠偶聯(lián)的熒光素分子）和細(xì)胞孵育相結(jié)合，最后借助熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察判定。通過(guò)將豬瘟活疫苗稀釋后，接種到豬睪丸細(xì)胞（ST）中，經(jīng)培養(yǎng)、固定、洗脫、抗體結(jié)合后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察，如果含有豬瘟疫苗毒，則會(huì)看到細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周?chē)辛辆G色的熒光，可判為陽(yáng)性。根據(jù)稀釋濃度及陽(yáng)性率計(jì)算豬瘟活疫苗的效價(jià)。間接免疫熒光檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)結(jié)果直觀(guān)，易于判斷。缺點(diǎn)是疫苗毒接種細(xì)胞后培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致檢測(cè)周期長(zhǎng)，需要專(zhuān)業(yè)能力較高的人員進(jìn)行操作。而且，目前間接免疫熒光的方法多數(shù)為自建方法，不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的熒光抗體等試劑差異較大，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time fluorogenetic quan-titative PCR,FQ-PCR）檢測(cè)法是把PCR技術(shù)與熒光化學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，并且在PCR反應(yīng)體系中添加能夠產(chǎn)生熒光特性的物質(zhì)，這種熒光物質(zhì)在PCR反應(yīng)過(guò)程之前不產(chǎn)生熒光，當(dāng)PCR反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，熒光信號(hào)就以特異方式被激發(fā)。熒光定量PCR是最敏感和最特異性的抗原檢測(cè)方法。近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR以靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，在傳染病的檢測(cè)以及其他定量方面得到了較好的應(yīng)用。而且這種方法應(yīng)用于檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗的效價(jià)，在我國(guó)也可以查到相關(guān)的論文。陳玉棟[4]等運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)豬瘟兔化弱毒疫苗進(jìn)行檢測(cè)，并與兔體定型熱法比較，分析并驗(yàn)證了兔體定型熱檢測(cè)豬瘟兔化弱毒活疫苗與熒光定量PCR檢測(cè)豬瘟兔化弱毒活疫苗之間具有良好的相關(guān)性。蔣春燕[5]等將熒光定量PCR技術(shù)與ABI定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，建立了豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)豬瘟活疫苗弱毒，效果良好。上述介紹的研究，能夠看到熒光定量PCR檢測(cè)豬瘟活疫苗效價(jià)具有很好的應(yīng)用前景。

3 檢測(cè)豬瘟病毒方法與特點(diǎn)

目前檢測(cè)豬瘟病毒抗原的方法主要是熒光定量PCR、ELISA抗原捕獲法和間接免疫熒光技術(shù)。熒光定量PCR反應(yīng)靈敏，如果操作不當(dāng)，可造成假陽(yáng)性；ELISA抗原捕獲法避免了提取RNA的操作，但所用的試劑盒價(jià)格較高，且大多數(shù)依賴(lài)進(jìn)口；間接免疫熒光（IFA）試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，而且熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果時(shí)容易受到個(gè)人主觀(guān)因素影響。

4 小結(jié)

隨著科技的進(jìn)步和行業(yè)的發(fā)展，尤其病毒學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展。豬瘟活疫苗采用兔體定型熱法進(jìn)行效力檢測(cè)的各種局限性越來(lái)越明顯，因此，研究新型豬瘟活疫苗效力檢測(cè)方法，探索實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA抗原捕獲法、間接免疫熒光（IFA）等現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，使得豬瘟活疫苗效力檢測(cè)更準(zhǔn)確、更方便快捷。先進(jìn)的豬瘟病毒檢測(cè)方法可以確保豬瘟活疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量，節(jié)省豬瘟活疫苗生產(chǎn)廠(chǎng)家的生產(chǎn)成本，提高疫苗生產(chǎn)效率具有重要的意義。