2021年河南南陽地區豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因遺傳進化分析

饒 丹

（信陽農林學院牧醫工程學院，河南信陽 464000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的危害母豬繁殖系統和仔豬呼吸系統的一類烈性傳染病。1987年，美國首次在商品豬中報告豬繁殖與呼吸綜合征病毒，此后該疾病頻繁發生并迅速蔓延到世界各地[1]。1995年我國第一次分離到PRRSV，此后，該病毒又在我國多地豬場中被發現[2]。PRRS對養殖經濟效益的影響主要是導致母豬產仔率下降和斷奶仔豬數減少。生長育肥豬感染PRRSV后可能會增加繼發感染其他疫病的概率，最終造成死亡率增加，此外，治愈豬只則表現生長遲緩、屠宰豬年齡體重高度分散[3]。2006年，我國出現高致病性PRRSV引起豬無名高熱，致使大量豬死亡[4]。2014年，NADC30-like毒株的發現是該病毒毒株出現的又一次重大變異，其結果是使用現有的商品化疫苗接種效果不好，給PRRS防控帶來新的難度[5]。

PRRSV屬于尼多病毒目（Nidovirales）、動脈炎病毒科（Arterividae）、動脈炎病毒屬[6]，本病毒有囊膜且病毒粒子呈卵圓形，直徑50～65 nm，結構為二十面體。PRRSV包含10個開放閱讀框：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF 3-5、ORF2b、ORF 5a 和 ORF 6-7。ORF1a和ORF1b編碼至少16個非結構蛋白：nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp2TF、nsp2NF、nsp3-6、nsp7α、nsp7β、nsp8-12。GP3和GP5在結構蛋白中也是高度可變的。nsp2、GP3和GP5常用于遺傳變異和分子流行病學的系統發育分析[7]。由于遺傳和抗原的差異，PRRSV分為：歐洲型（EU型，1型）和美洲型（NA型，2型）。我國主要以PRRSV 2的流行為主[8]。

近年來PRRSV不斷發生變異，給養豬業造成難以估計的損失。為了更好地了解南陽地區該病的遺傳變異情況以及為該地區的防控提供科學的依據，本研究對南陽地區疑似PRRS病料樣品進行ORF5基因序列測定，同時參考國內外已知的基因序列繪制國內外PRRS的遺傳進化關系示意圖，分析南陽地區PRRSV的遺傳變異規律，為我國PRRS的防控提供相關的參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2021年在河南南陽（NY）地區采集8份疑似PRRS豬的脾臟、肺臟、肺門淋巴結等組織，并于-20℃保存備用。

1.2 主要試劑

Trans2K DNA Marker購自北京全式金生物技術股份有限公司；Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素購自Solarbio；膠回收試劑盒購自OMEGA；大腸桿菌TOP10感受態細胞購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物設計

參考GenBank中發表的PRRSV ORF5基因序列，設計出擴增目的片段約為704 bp的特異性引物：GP5-F：5’-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGCC-3’；GP 5-R：5’-AAGGTGCTTTTGGCGTTTTC-3’。引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。

1.4 ORF5基因的擴增及克隆

無菌采集患病豬的淋巴結、脾臟等組織作為病料，取1 g置于1.5 mL的EP管中，并用手術剪剪碎，加入沒過2/3病料組織的0.9%生理鹽水；研磨后勻漿，8 000 rpm離心3 min；取上清液置于一新的1.5 mL EP管中，并按核酸提取試劑盒要求操作提取總RNA。以其為模板，采用AMV反轉錄酶進行反轉錄制備cDNA。以cDNA為模板，GP5-F/GP5-R為引物，PCR擴增ORF5基因。參數如下：95℃3 min；95℃30 s、56℃30 s、72℃1 min，34個循環；72℃5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用凝膠回收試劑盒回收，克隆于pMD18-T載體中，陽性重組質粒送祥音生物科技有限公司進行測序。

1.5 序列分析

參考GenBank登錄的國內外PRRSV參考病毒株序列，利用DNA Star、MegAligen、MEGA 5.1軟件對不同病毒株的ORF5基因序列進行比較分析，繪制PRRSV遺傳演化圖。PRRSV參考毒株信息見表1。

表1 PRRSV參考毒株信息

2 結果與分析

2.1 ORF5基因的RT-PCR擴增結果

對采集的疑似PRRS病料樣品采用特異性引物進行PRRSV ORF5基因的RT-PCR擴增，結果顯示，從患病仔豬的病料中擴增出8份陽性樣品，分別命名為THX01、THX02、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07、XYX08。瓊脂凝膠電泳檢測結果與預期相符（圖 1）。

圖1 疑似PRRS病料樣品ORF5基因RT-PCR擴增結果

2.2 ORF5基因核酸遺傳進化分析

對得到的8份陽性樣品的基因測序均得到預期704 bp的片段。為分析各病毒株間遺傳進化情況，采用DNA Star軟件對獲得的8個完整的ORF5基因序列及23個從GenBank下載的國內外參考病毒株序列進行多序列比較，構建南陽地區PRRSV毒株的遺傳進化關系圖（圖2）。結果顯示，進化樹分為2大支，即以VR-2332為代表的美洲型分支和以Lelystad virus為代表的歐洲型分支。其中，美洲型又可進一步分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等5個亞型，代表毒株為NADC30、GM2、CH-1a、VR-2332和 HUN4表示。THX01、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07、XYX08 與 NADC30、JL580處于同一分支，親緣關系較近屬于Subgroup I。THX02與HUN4、JXA1等的高致病性代表毒株處于同一分支，親緣關系較近屬于Subgroup V。

圖2 PRRSV ORF5基因遺傳進化分析

2.3 GP5蛋白的氨基酸比對分析

目前已確定的美洲型病毒株GP5蛋白的表位有3個，2個為非中和表位（aa27～aa30和 aa180～aa197）如圖3實線框表示；1個為中和表位（aa37～aa45）如圖3虛線框；2個重要的抗原相關區域：胞外域（aa27～aa41）和C末端（aa180～aa197）。結果如圖3，與V-R2332毒株相比，在非中和表位27～30位氨基酸，主要是第27和29位氨基酸發生突變；與美洲型代表毒株VR-2332相比，THX01、THX04、XYX05、XYX06、XYX07、XYX08的第27位氨基酸V突變為A。而這6株與NADC30、JL580、CHsx1401一致。在第28位氨基酸處只有XYX08株發生突變，由L突變為F。在第29位氨基酸處與美洲型代表毒株VR-2332相比，XYX05、XYX06 和 XYX07 的 A29T，THX01、THX02、THX03、THX04、XYX08 與 RespPRRS-MLV、CH-1a、CH-1R、HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、QYYZ、GDsg、NADC30、JL580、CHsx1401一致。在aa180～aa197中，在 185位 8個毒株與 HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、QYYZ、GDsg、NADC30、JL580、CHsx1401一致，但與VR-2332相比發生V突變為A；在第189位，THX01、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07和 XYX08與 Resp-PRRS-MLV、QYYZ、NADC30、JL580、CHsx1401 一致，但與VR-2332相比發生I突變為V。THX02與CH-1a、CH-1R、HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、GDsg一致，但與VR-2332相比發生I突變為L；在第191位，THX01、THX04、XYX05、XYX06、XYX07與QYYZ、NADC30、JL580、CHsx1401一致，但與VR-2332相比發生R突變為K。THX02、THX03、XYX08與VR-2332一致；在第192位，8個毒株與VR-2332相比發生V突變為I；在第196位，THX02與QYYZ一致，與VR-2332相比發生Q突變為R。在中和表位aa37～aa45，主要突變發生在39位，THX02與HUN4、JXwn06、JXA1、JXA1-P80、GDsg一致，但與VR-2332相比發生L突變為I。在第41、44位，XYX05、XYX06、XYX07與VR-2332相比分別發生L突變為S、N突變為K。總體來說，本試驗8株與美洲型代表毒株相比，在非中和表位aa27～aa30中，發生V突變為A、A突變為T、L突變為F；和非中和表位aa180～aa197中，發生185位的V突變為A、189位的I突變為V、189位的I突變為L、191位的R突變為K、192位的V突變為I、196位的Q突變為R。在中和表位aa37～aa45，發生39位的L突變為I、41位的L突變為S、44位的N突變為K。顯示基因間的突變，最終與其病毒的毒力差異相關。

圖3 PRRSV GP5蛋白氨基酸比對分析

3 討論

第一個PRRSV毒株（VR-2332）于1992年在北美洲被分離，第一個中國毒株（CH-1a）于1996年被報道以來，該病毒給我國養豬場造成了巨大的經濟損失[9]。PRRSV變異快，各毒株之間存在較大差別。一般變異出現的中間型新毒株，其抗原表位發生突變，影響抗原抗體相互結合，致使PRRSV的疫苗免疫效果較差或失敗。

因此，通過對南陽地區的PRRSV GP5分離株的序列變異進行研究，為合理選擇疫苗和PRRSV防控措施提供科學依據。Zhang等[10]報道了近年來中國豬群中出現PRRSV的2個新的基因亞型：Ⅲ型和Ⅳ型。Li等[4]報道，我國的豬群在2013年就出現了NADC30-like毒株，該毒株可使母豬發熱、流產。系統發育分析表明2型PRRSV分離株可分為5個亞屬類型（I、II、III、IV和V），這些亞屬類型的代表毒株分別為 NADC30、VR-2332、GM2、CH-1a和JX1A。在試驗中觀察到THX02與HUN4、JXA1等的高致病性代表毒株處于同一分支屬于 Subgroup V。THX01、THX03、THX04、XYX05、XYX06、XYX07和XYX08與變異毒株NADC30處于同一分支屬于Subgroup I。對GP5蛋白氨基酸變異進行分析后，發現GP5蛋白的3個表位區域存在較多的氨基酸變異，說明基因之間的變化與兩者之間的毒力有關。這些氨基酸位點的突變大概會致使GP5蛋白免疫原性產生變化，也可能導致疫苗免疫效價變低甚至無效，最終使豬場的疫苗免疫失效。

4 小結

在河南南陽地區分離的8株繁殖與呼吸綜合征病毒的GP5分離株，1株THX02屬于高致病性毒株，其余7株屬于變異毒株，說明南陽地區豬場中豬繁殖與呼吸綜合征病毒的高致病性毒株仍在流行，同時有PRRSV變異株出現，因此有必要實時監測PRRSV的毒株流行情況，為該地區防控PRRS提供參考。