Carba plus紙片法測定CRE的碳青霉烯酶的能力評估及與β-內酰胺酶耐藥基因的關系

高爽（遼寧省盤錦檢驗檢測中心,遼寧 盤錦 124080）

由于碳青霉烯類抗菌藥物的過度使用，耐藥腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)菌株的檢出率呈上升趨勢，產碳青霉烯酶菌株對碳青霉烯類抗菌藥物具有耐藥性，對幾乎所有的β-內酰胺類抗菌藥物都存在耐藥，CRE對全球的公共衛生安全都造成了威脅[1]。因此，快速、準確地檢測耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌十分必要。目前，主要采用Carba NP試驗及碳青霉烯類失活試驗法檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶，但以上檢測方法只能檢測碳青霉烯酶的活性，不能區分碳青霉烯酶的類型，因此，亟需找到一種能快速、準確對碳青霉烯酶類型進行區分的檢測方法[2]。Carba plus紙片法通過酶抑制劑原理，通過讀取抑菌圈直徑區分碳青霉烯酶的類型[3]。碳青霉烯類抗生素是一種常見的廣譜抗菌藥物，由于廣泛應用，耐碳青霉烯類抗生素的細菌不斷增加，耐藥機制主要為可水解的碳青霉烯類抗生素β-內酰胺酶-碳青霉烯酶產生[4]。為了進一步研究耐碳青霉烯類菌株的耐藥原因，本研究旨在探討Carba plus紙片法檢測耐藥腸桿菌科細菌的碳青霉烯酶類型的評估能力及與β-內酰胺酶耐藥基因的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集醫院2018年6月-2020年6月臨床分離非重復的65株耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌為研究組，另選取同期分離的68株碳青霉烯類敏感腸桿菌科細菌為對照組。

1.2 儀器與試劑 儀器：VITEK-MS質譜儀和VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏儀、CFX96熒光定量PCR擴增儀、Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠成像系統、GNP29270型恒溫孵育箱、BG-subMIDI(v)可見光電泳透射儀。

試劑：VITEK-MS CHCA基質液、血瓊脂平皿和亞胺培南藥敏紙、M-H藥敏瓊脂平皿、Mastdiscs combi Carba plus試劑盒、Premix TaqTM酶、DLl000 DNA Marker和DL2000 DNA Marker、PCR 擴增試劑、培養基。

1.3 方法

1.3.1 Carba plus紙片法檢測 根據紙片擴散法的藥敏試驗操作步驟，配制0.5麥氏濁度新鮮菌懸液，在MH藥敏平皿均勻涂布上，將Carba plus紙片(A-E)、亞胺培南紙片均貼在藥敏平板上，使各紙片間保持足夠的距離，以便出現清晰的抑制區。于35℃條件下孵育18-24h，對每張紙片的抑菌圈直徑進行測量。

1.3.2 耐藥基因檢測 通過煮沸法對細菌DNA模板進行提取，用特異性引物對碳青霉烯酶基因、β-內酰胺酶耐藥基因進行擴增。

1.3.3 PCR檢測 PCR體系：Taq PCR Master Mix體系12.5tA，ddH2O 9.5pL，上游引物和下游引物各1弘L，模板DNA1 td。

PCR反應條件：于94℃條件下進行預變性5min；于94℃條件下變性30s，退火30s；于72℃條件下進行延伸；重復變性、退火、延伸，30個循環；于72℃條件下繼續延伸7min。將擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，再放凝膠成像上進行觀察。

1.4 Carba plus紙片法檢測碳青霉烯酶的評價 以PCR耐藥基因序列分析作為診斷金標準[5]，比較Carba plus紙片法檢測碳青霉烯酶的診斷效能。

診斷敏感度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%，診斷特異度=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數）×100%，診斷準確度=（真陽性例數+真陰性例數）/總例數×100%。陽性預測值（%）=真陽性/（真陽性+假陽性）×100%。陰性預測值（%）=真陰性/（真陰性+假陰性）×100%。

1.5 統計學分析 以SPSS20.0軟件行數據分析，計數資料以[n(%)]形式顯示，行χ2檢驗。

2 結果

2.1 Carba plus紙片法檢測結果與耐藥基因序列分析結果對比 65株耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌菌株Carba plus紙片法檢測結果：KPC陽性37株，MBL陽性21株，OXA-48陽性4株，未檢測出產酶類型3株；68株碳青霉烯類敏感腸桿菌科細菌菌株均未檢測出產酶類型。見表1。

表1 Carba plus紙片法檢測結果與耐藥基因序列分析結果對比

2.2 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測KPC酶的結果比較 以耐藥基因檢測作為檢測碳青霉烯酶類型的金標準，得到Carba plus紙片法預測腸桿菌科細菌產KPC酶的準確度為94.74%，敏感度為84.44%，特異度為100.00%，陽性預測值為84.44%，陰性預測值為100.00%。見表2。

表2 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測KPC酶的結果比較

2.3 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測MBL酶的結果比較 以耐藥基因檢測作為檢測碳青霉烯酶類型的金標準，得到Carba plus紙片法預測產MBL酶的準確度為97.74%，敏感度為100.00%，特異度為97.37%，陽性預測值為86.36%，陰性預測值為100.00%。見表3。

表3 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測MBL酶的結果比較

2.4 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測OXA-48酶的結果比較 以耐藥基因檢測作為檢測碳青霉烯酶類型的金標準，得到Carba plus紙片法預測產OXA-48酶的準確度為99.25%，敏感度為100.00%，特異度為99.23%，陽性預測值為100.00%，陰性預測值為100.00%。見表4。

表4 Carba plus紙片法與PCR耐藥基因序列分析檢測OXA-48酶的結果比較

2.5 耐藥基因擴增結果 65株CRE中有24株菌產碳青霉烯酶，其中18株CRE同時攜帶其他β-內酰胺酶耐藥基因；65株CRE中有39株產CTX-M型ESBL酶，3株CRE產DHA-1型質粒介導的AmpC酶。

3 討論

碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣、抗菌活性最強的非典型β-內酰胺抗生素，對產超廣譜β-內酰胺酶及AmpC酶的細菌具有較強的抗菌作用[6-8]。由于CRE的耐藥形勢十分嚴峻，且耐藥機制較多樣，發生CRE感染會導致嚴重的后果，對CRE菌株進行快速、正確的診斷，有助于區別產酶類型，有助于明確感染暴發的流行本質[9]。Carba plus紙片法是一種鑒定產碳青霉烯酶類型的新方法，通過酶抑制劑原理，讀取抑菌圈直徑，以對KPC型、MBLs型、OAX-48型碳青霉烯酶進行區別，在鑒定產酶時還能夠分析菌株的產酶類型，為控制醫院感染提供實驗室依據[10-11]。隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛應用，耐藥的細菌不斷增加，認為其耐藥機制與碳青霉烯酶的產生有關[12]。

本研究結果顯示，Carba plus紙片法預測產KPC酶的敏感度僅為84.44%。考慮原因可能與KPC基因的編碼質粒出現轉移有關[13]。Carba plus紙片法預測產MBL酶的敏感度、陰性預測值均為100.00%，但陽性預測值僅為86.36%。考慮原因與選取的產MBL酶菌株的基因型種類不全有一定的關系[14]。Carba plus紙片法預測產OXA-48酶的特異度為99.23%，沒有達到100.00%。考慮原因可能為Carba plus紙片中有替莫西林，替莫西林使肺炎克雷伯桿菌產生耐藥，出現假陽性，使產OXA-48酶的特異度變低[15]。

綜上所述，Carba plus紙片法可準確區別CRE菌株的產酶類型；CRE的碳青霉烯酶的耐藥機制為攜帶KPC型的碳青霉烯酶基因，與β-內酰胺酶耐藥基因有關。