碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌的實驗室檢測與臨床轉(zhuǎn)歸危險因素分析

黃燕惠,徐靖,羅文軍（江西省撫州市臨川區(qū)第一人民醫(yī)院,江西 撫州 344100）

作為臨床當中比較多見的條件致病菌，肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumonia，KPN）在免疫功能比較弱的患者、老人、新生兒中易引發(fā)尿路感染、肺炎等疾病。但是，相較于普通的肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella Pneumonia，cKP）來說，在毒性方面，高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella Pneumonia，HvKP）相對更高，會導(dǎo)致健康的年輕人發(fā)生重度的社區(qū)獲得性感染，譬如腦炎、肝膿腫等，具顯著的侵襲性[1]。因為抗生素的運用缺少規(guī)范性，再加上耐藥質(zhì)粒和毒力質(zhì)粒在細菌之間的傳播十分迅速，現(xiàn)如今出現(xiàn)了碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent and carbapen-em-tesistant Klebsiella pneumonia，CR-HvKP）[2]。CR-HvKP的侵襲力非常強，有著HvKP的特性，播散幾率高，會導(dǎo)致胸腔、血流感染和其他器官的感染等[3-5]。近些年，CR-HvKP檢出率持續(xù)提升，使得臨床的醫(yī)治難度增加，而且已經(jīng)是臨床中造成患者死亡的一個關(guān)鍵因素[1,6]。各個地區(qū)CR-HvKP感染狀況以及致死狀況都有所區(qū)別。此次研究主要對本院CR-HvKP的實驗室檢測及臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)危險因素展開分析與探討，以期為臨床工作提供參考與支持。

1 資料和方法

1.1 研究對象 挑選40例于2019年1月-2020年12月在我院接受治療的CR-HvKP感染患者，對其展開回顧性研究。其中源于痰/肺泡灌洗液標本、血培養(yǎng)、腹腔引流液的分別為32例、6例、2例。

1.2 儀器和和試劑 全自動微生物鑒定儀（制造商為法國生物梅里埃公司Vitek2 Compact）、凝膠成像儀（制造商為美國Bio-Rad公司）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增儀（制造商為美國Bio-Rad公司）、細菌DNA提取試劑盒（制造商為北京天根生化科技有限公司）、電泳儀（制造商為上海康華公司）、2×Taq Master Mix（制造商為北京康為科技有限公司）、50×TAE 緩沖液（制造商為上海生工有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集 對研究對象的住院天數(shù)、年齡、臨床抗生素治療方案、治療成效、感染嚴重程度評估等信息資料進行收集，并且做好無誤記錄。

1.3.2 菌株鑒定和藥敏試驗 菌株鑒定和藥敏試驗選用的是全自動微生物鑒定儀Vitek2 Compact，借助E-test法完成替加環(huán)素的藥敏試驗，藥敏結(jié)果判定標準以CLSI2016年為參照；質(zhì)控菌株是肺炎克雷伯菌ATCC700603、大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.3 高黏液表型檢測 運用拉絲試驗方法，通過接種環(huán)挑取血瓊脂平板上新鮮菌落做牽拉，黏液絲形成而且長度不小于5mm則可做出高黏液表型陽性的判斷，反之則可作出陰性的判斷。

1.3.4 高毒力肺炎克雷伯菌菌株 以文獻[7-8]資料為參照，選擇運用PCR檢測毒力基因（rmpA2、rmpA）、碳青霉烯酶基因（OXA、KPC-2、VIM、NDM-1、IMP）、血清型（K2、K1）。1.3.5 碳青霉烯酶表型檢測 借助接種環(huán)來對受試菌株進行刮取，而且添至2ml TSB里，緊接著在菌懸液里浸入10μg美羅培南紙片，再以無菌棉簽對大腸埃希菌ATCC25922菌懸液（0.5麥氏濁度單位）進行蘸取，并在M-H、瓊脂平板上涂抹勻稱，最后從菌懸液里拿出藥敏紙片，貼于該M-H瓊脂平板上。結(jié)果判讀：抑菌圈直徑為6-15mm或是在16-18mm抑菌圈里有菌落出現(xiàn)，則為碳青霉烯酶陽性。

1.3.6 血清殺傷試驗 把血清抗體放進肺炎克雷伯菌懸液里，接種在Mueller-Hinton瓊脂板，1h之后菌量達到10%-100%，3h后＜10%則可判定為高敏感；1h、2h、3h后均過度生長＞100%則可判定為抵抗組，1h內(nèi)過度生長＞100%，2h后或3h后＜100%則可判定為中敏感。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析選擇運用SPSS21.0軟件，以頻數(shù)代表計數(shù)資料，運用Fisher確切概率法或χ2檢驗，以(±s)代表計量資料，運用t檢驗。若P＜0.05則提示對比區(qū)別存在統(tǒng)計學(xué)價值。

2 結(jié)果

2.1 患者的實驗室檢測結(jié)果 研究對象中，女性、男性分別為6例、34例，標本來源以痰/肺泡灌洗液為主，有32例，占比約為80%。所有入選的患者的毒力基因rmpA2都是陽性；拉絲試驗陽性34例，占比約為85%；K2型血清型有32例，占比約為80%；血清殺傷試驗都是抵抗組；碳青霉烯酶表型mCIM都是陽性；碳青霉烯酶基因KPC-2型36例，占比約為90%。詳細數(shù)值可見表1。

表1 患者的實驗室檢測結(jié)果

2.2 患者臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)危險因素分析 研究對象中，治療好轉(zhuǎn)、無效的分別為18例、22例，治療有效率是45%。對比治療無效組和治療好轉(zhuǎn)組的患者年齡區(qū)別并不存在統(tǒng)計學(xué)價值（t=1.445，P＞0.05）；對比兩個小組的感染性休克、氣管插管輔助呼吸方面的區(qū)別都存在統(tǒng)計學(xué)價值（χ2=5.689，χ2=7.592，均P＜0.05）。詳細數(shù)值可見表2。

表2 患者臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)危險因素分析

3 討論

現(xiàn)如今，國內(nèi)外臨床實驗室主要是以拉絲試驗陽性來對HvKP進行判定[9-10]。而在此次研究當中，一些HvKP拉絲試驗卻是陰性，所以，此次研究參照文獻[7-8]，借助毒力基因rmpA/rmpA2陽性和血清殺傷試驗抵抗組來對HvKP作出判定。在以往，普遍認為HvKP極少會對抗生素產(chǎn)生耐藥性，除了天然耐藥氨芐西林以外，絕大部分菌株對于常用藥物都比較敏感。然而，近幾年有研究指出HvKP有多種結(jié)合以及整合元素存在，導(dǎo)致毒力基因/耐藥基因經(jīng)質(zhì)粒傳播于細菌之間[11-14]。當前，能夠形成CR-HvKP的途徑有兩種，具體如下：其一，HvKP借助質(zhì)粒得到碳青霉烯酶基因而形成CR-HvKP，并且能夠迅速傳播于細菌之間[13-14]；其二，碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）借助質(zhì)粒得到毒力基因，從而促進其形成[15]。傳播性強、耐多藥、毒性高，這是CR-HvKP的突出特點，所以其又被叫做真正超級細菌，為醫(yī)院感染控制以及臨床治療帶來了不小的考驗。所以，對其展開實驗室檢測和臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)危險因素分析是極具現(xiàn)實價值的。

從此次研究的結(jié)果可以看出，碳青霉烯酶基因主要是KPC-2型，這和楊欣[16]等的研究結(jié)果基本無異。血清型主要是K2，同盧峰[17]等的研究結(jié)果大致相同，而李麗[18]等曾對5例K1血清型的CR-HvKP進行了報道，付雪松[19]等曾對2例K1型和2例K2型的CR-HvKP進行了報道，表明現(xiàn)如今無論是K1還是K2血清型都已有CR-HvKP出現(xiàn)，而在我院主要是K2血清型，還需深度探究其存在的詳細機制。mCIM試驗是對碳青霉烯酶表型確認檢測的手段，特異性及敏感度都極高[20]。此外，此次研究還對比了治療無效組和治療好轉(zhuǎn)組感染性休克、氣管插管呼吸機輔助呼吸的情況，發(fā)現(xiàn)對比區(qū)別都存在統(tǒng)計學(xué)價值。可見，這些并發(fā)癥都會對治療成效造成干擾。此次研究結(jié)果表明，CR-HvKP的臨床治愈率偏低，即便已經(jīng)治療痊愈，相較于肺炎克雷伯菌感染來說，在嚴重程度和用藥天數(shù)等方面都相對更高。所以，對此類患者的預(yù)后評估工作具有極高的復(fù)雜度，需基于藥品選用、輔助治療、基礎(chǔ)疾病等進行全面的思考，從而做出客觀的判斷。

總而言之，在臨床中，CR-HvKP感染具有較強的傳播性，而且治愈率偏低，對其必須加以高度重視。