快速現場評價聯合徑向支氣管內超聲在經支氣管冷凍活檢診斷彌漫性肺疾病中的應用

陳偉莊，李優，王輝，周瑩艷，王國安，沈世茉，陳金平，吳仕波，吳宏成

1.寧波市醫療中心李惠利醫院 呼吸與危重癥醫學科，浙江 寧波 315040；2.寧波市臨床病理診斷中心，浙江 寧波 315021

彌漫性肺疾病（diffuse lung diseases,DLD）的診斷目前仍然是一個難點。通過多學科討論全面分析病史、臨床表現、血清學及影像學等輔助檢查可以幫助確診，但仍有高達30%的病例需要進行組織病理學評估才能明確診斷[1]。過去，外科肺活檢（surgical lung biopsy,SLB）一直被認為是診斷DLD的金標準，但創傷大、費用高、死亡率高等因素限制了其應用[2]；經支氣管鉗活檢（transbronchial forceps biopsies,TBFB）所獲得的標本較小，難以獲得滿意的病理診斷，診斷率很低（20%～30%）[3]。經支氣管冷凍活檢（transbronchial cryobiopsy,TBCB）是一種新興的獲取肺組織的診斷方法，相比較TBFB，TBCB可以獲得更大的標本和更高的診斷 率[4]；同時，相比于SLB，TBCB有著創傷小、安全性高的特點，但其主要運用于肺惡性腫瘤方面，在DLD中報道較少。由于DLD的病變往往處于肺外帶野區域，為了確保冷凍探頭處于病灶內，需要結合X光透視引導，這會增加醫務人員和患者的射線暴露。徑向支氣管內超聲（radial-endobronchial ultrasound,R-EBUS）被廣泛應用于肺外周病變的探查，利用超聲成像原理，了解外周病灶與支氣管、血管結構位置，以提高診斷率及減少并發癥[5]。“實時伴隨技術”的快速現場評價（rapid on site evaluation,ROSE）幾乎成為現代化介入肺臟病診療中心的“標配”[6]，但R-EBUS技術與ROSE更多地運用于惡性腫瘤的鑒別上，在DLD等良性疾病上的報道也較少。本研究觀察聯合應用ROSE與R-EBUS技術輔助TBCB在DLD診斷中的安全性。

1 資料和方法

1.1 主要資料

1.1.1 病例資料：收集2019年6月至2021年9月在寧波市醫療中心李惠利醫院行TBCB檢查的患者。納入標準：年齡＞18 歲，高分辨率計算機斷層掃描（high-resolution computed tomography,HRCT）顯示有DLD的證據，綜合臨床病史、實驗室檢查和HRCT表現后無法確定診斷。用力肺活量≥預測值的50%，一氧化碳彌散量≥預測值的40%。排除標準：術前30 d有急性加重，凝血功能異常，正在抗凝或者抗血小板治療，肺動脈高壓，任何I型或II型呼吸衰竭，任何II級及以上的心力衰竭（NYHA分級），血小板計數＜50×109/L，國際標準化比值（international normalized ratio,INR）高于1.5，臨床資料不完整者。

1.1.2 主要設備及材料：BF260支氣管鏡系統（支氣管鏡外徑4.9 mm，工作孔道直徑2.0 mm）購于日本Olympus公司，20416-037冷凍探頭（直徑1.9 mm）購于德國ERBE公司，M00550340球囊擴張導管購于愛爾蘭波士頓科技公司，AG-5041-3545一次性導絲購于杭州安杰思醫學科技有限公司，7.5 號加強有囊型氣管插管購于浙江伏爾特醫療器械股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 團隊人員構成：ROSE操作、判讀人員由在寧波市病理中心細胞專業組病理科醫師指導下進行學習、培訓3個月的呼吸科醫師完成；R-EBUS操作及TBCB操作由呼吸內科內鏡介入組有資質的手術醫師操作；所有送檢標本報告由寧波市病理中心發布。

1.2.2 術前準備：所有患者術前均行血常規、生 化、凝血功能、血氣分析、心電圖、肺功能、心臟彩超、胸部增強CT、顱腦增強MRI等檢查。所有患者術前禁食禁飲（術前夜晚8點禁食，10點禁水）。

1.2.3 R-EBUS及TBCB操作過程[7]：全身麻醉后，建立氣管通路，密切監測生命體征，在相應支氣管腔預置球囊。根據HRCT結果選擇用于TBCB的支氣 管，將R-EBUS探頭插入選定的支氣管，直至到達最遠端（胸膜表面）為止，然后將R-EBUS探頭后撤1～2 cm開始工作（頻率：20 MHz，范圍：4 cm）并緩慢回撤向肺門，并評估R-EBUS信號的特征（識別血管信號，暴風雪征，密集征，結節征，見圖1）。選擇REBUS表現出暴風雪或密集征象且無血管的部位作為TBCB的理想活檢部位，估算R-EBUS探頭的撤退距離。將1.9 mm冷凍探頭以R-EBUS探頭相同方式送至理想活檢部位（根據估算距離）。在6 MPa壓力下冷凍 3 s后立即將探頭與軟鏡一起拉出，溫0.9%氯化鈉溶液融化冷凍的肺組織。取下標本后立即測量大小[長徑×短徑=面積（mm2）]。行ROSE涂片后將取出的肺組織固定于甲醛溶液送檢病理。在冷凍探頭與軟鏡一起拉出時，助手立即注入預定水量充盈預置球囊。取下標本后操作者再次進支氣管鏡，直視下將球囊緩慢排空，若見明顯活動性出血可立即再次充盈球囊，反復觀察，直至出血停止，必要時注入稀釋的去甲腎上腺素混合冰0.9%氯化鈉溶液收縮血管協助止血，嚴重者靜脈使用止血藥物。確認無明顯出血后，聽診活檢側肺呼吸音，排除氣胸可能。若無明顯出血及呼吸音減低，可再次活檢。根據ROSE報告微調活檢深度，肉眼觀標本大小調整冷凍時間（逐秒調整，最大6 s以內），根據出血情況等綜合因素決定操作進程。活檢術畢待患者清醒后，送入復蘇室，無異常后送返病房并予常規術后監護。

圖1 R-EBUS的特征標志

1.2.4 ROSE工作流程：靶部位取材后，將冷凍探頭置于溫0.9%氯化鈉溶液，取下肺組織，用5 mL注射器針頭將組織粒挑起，在無菌細胞學專用玻片中央處自內向外涂抹出直徑約1 cm的圓形，然后將印片后的組織粒固定于甲醛溶液送檢病理[6]。WHO推薦采用迪夫染液對ROSE細胞學片基進行快速染 色[8]。把片基浸泡于迪夫A溶液（20 s）；再于PBS染缸中洗掉迪夫A溶液，甩干緩沖液；而后再把片基浸泡于迪夫B溶液（20 s）；最后清水染缸中水洗，以吸水紙吸干、擦干玻片殘留液體，完成染色。評估ROSE診斷結果及鏡下細胞學特征：①肉眼觀組織粒標本大小及是否具有支氣管樹結構；②鏡下觀察纖毛、上皮細胞成分；③觀察非上皮細胞成分（巨噬細胞、類上皮細胞、纖維母細胞、肺泡上皮細胞等），見圖2。正常氣管到細支氣管為假復層纖毛柱狀上皮細胞，終末細支氣管到呼吸性細支氣管中段為單層纖毛柱狀上皮細胞，呼吸性細支氣管以下的肺泡管、肺泡囊為無纖毛的單層柱狀或單層扁平上皮細胞。以此判斷取材位置滿意程度，跟操作醫師交流，調整冷凍肺活檢過程。

圖2 TBCB的ROSE細胞學涂片

1.2.5 并發癥觀察：TBCB最常見的并發癥是出血和氣胸。按文獻[9]所述分類，沒有或極少量出血：只需單獨吸引即可止血；輕度出血：需要使用（1:20）稀釋去甲腎上腺素混合冰0.9%氯化鈉溶液局部止血；中度出血：需要再次使用球囊或者靜脈止血藥物止血；重度出血：需要重癥監護治療，輸血或者外科手術止血。氣胸根據肺壓縮程度分為輕度（肺壓縮＜30%）、中度（肺壓縮 30%～50%）及重度（肺壓縮≥50%）。術后密切觀察患者是否出現發熱、呼吸困難、咳嗽咳痰加重、咯血或痰中帶血等情況。常規次日復查胸片排除氣胸。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS22.0統計軟件。正態分布計量資料用表示，兩組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料用M（P25，P75）表示，采用Wilcoxon秩和檢驗，計數資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 本研究共收集52例患者，其中男20例，女32例，年齡18～75（54.0±13.2）歲；體質量40～102（60.93±13.22）kg；身高140～178 （161.58±9.48）cm；從未吸煙者39例，戒煙者（戒煙時間大于1年）2例，未戒煙者11例。

2.2 TBCB、并發癥情況 52例患者總共活檢182次，人均（3.50±1.00）次；標本大小6～30（13.69± 4.72）mm2；活檢部位：右上葉6例（共活檢15次），右中葉6例（共活檢22次），右下葉24例（共活檢81次），左上葉2例（共活檢9次），左下葉14例（共活檢55次）；并發癥：沒有或極少量出血20例，輕度出血21例，中度出血11例，重度出血0例；輕度氣胸2例，急性左心衰1例，低氧血癥1例。術后住院時間1～27 d，中位術后住院時間6（1.00，6.00）d；其中術后1 d出院患者有14例（26.92%）。

2.3 TBCB病理診斷 52例TBCB標本中，結合患者年齡、性別、職業、既往史、接觸史、吸煙史、實驗室血清學及影像學結果，最終得出臨床病理組織學結果。間質性肺疾病的診斷參照2013美國胸科學會/歐洲呼吸病學會的間質性肺疾病分類標準[10]。見表1。

表1 DLD臨床病理診斷[例（%）]

2.4 患者特征與出血程度的相關性 將沒有出血或極少量出血、輕度出血歸為低臨床出血組，中度出血、重度出血歸為高臨床出血組。單因素χ2檢驗結果表明，男性比女性具有更高的臨床出血程度（P=0.023），身高≥161.58 cm的患者比身高＜161.58 cm的患者具有更高的臨床出血程度（P= 0.013），差異有統計學意義；年齡、體質量、吸煙狀態、活檢位置和標本大小、活檢次數、出血程度差異無統計學意義（P＞0.05）；見表2。選擇性別、身高、體質量、吸煙狀態等變量進行二元Logistic回歸分析，結果顯示身高≥161.58 cm（OR=8.679，95%CI=1.646～45.762）可能增加TBCB出血的風險。

表2 不同患者特征、活檢位置、活檢次數、標本大小的出血程度比較

2.5 出血程度與TBCB術后住院時間的關系 在52例患者中去除2例氣胸、1例急性左心衰、1例低氧血癥，剩余48例患者，低臨床出血組的TBCB術后住院時間為5.5（1.0，6.0）d，高臨床出血組為6（2.8，6.0）d，兩組差異無統計學意義（Z=-0.314，P=0.774）。見圖3。

圖3 低臨床出血組和高臨床出血組的TBCB術后住院時間比較

3 討論

自2009年BABIAK等[11]首先報道了TBCB作為一種新的活檢技術用于DLD的診斷以來，特別是在間質性肺病（interstitial lung disease, ILD）領域，越來越受到關注。在美國的一項ILD的SLB大型回顧性研究中，擇期手術的院內死亡率為1.7%，非擇期手術院內死亡率為16%，在低SLB手術量的醫院有著更高的死亡率[12]。RAVAGLIA等[13]比較了150例SLB和297例TBCB，TBCB診斷率為82.8%，SLB診斷率為98.7%（P=0.013）；術后不良事件導致的死亡率，TBCB要低于SLB[分別為1/297（0.3%），4/150（2.7%），P=0.045]；兩組均未發生嚴重出血事件；TBCB的ILD急性加重率低于SLB[分別為1/297（0.3%），5/150（3.3%），OR=0.101（95%CI=0.012～0.857）]；TBCB平均住院時間比SLB短（分別為2.6 d、6.1 d，P＜0.001）。TROY等[1]在一項前瞻性多中心隊列研究中招募了65例患者，同一患者依次進行TBCB和SLB，兩者的組織病理學一致性為70.8%，特別是在多學科討論上具有較高或確定的診斷置信度的39 例TBCB，與SLB的一致性為94.9%。

出血和氣胸是TBCB最主要的并發癥。HETZEL等[4]報道了一項前瞻、隨機、多中心交叉試驗，納入了359 例患者，對同一患者隨機先后行TBCB和TBFB，使用X線透視進行定位，TBCB和TBFB的不同程度的出血率分別為：無出血27.3%vs.51.8%，輕度56.5%vs.44.0%，中度15.0%vs.4.2%，重度 1.2%vs.0，P＜0.001；與TBFB相比，TBCB的臨床高出血組（中度+重度）發生率更高（16.2%vs.4.2%，P＜0.05）；但兩組都沒有發生致命性出血。 DAVIDSEN等[14]對141例無法分類的ILD患者進行了前瞻性TBLC研究，有21例（14.9%）發生氣胸，其中14例（9.9%）進行了胸腔引流。SRYMA等[15]通過薈萃分析發現TBCB的組織平均面積為11.17～15 mm2，TBFB組織的平均面積為2～4.69 mm2。

綜上文獻所述，相比于TBFB，TBCB可以獲得更大的標本和更高的診斷率，盡管在出血和氣胸的發生率上要高于TBFB，但均沒有發生危及生命的嚴重事件；同時，TBLC與SLB之間的組織病理學有著較高的一致性，在安全性上，TBCB的死亡率、ILD急性加重率、平均住院時間都要低于SLB。因此，認為TBCB是高診斷率且低創傷風險、高安全性的診斷采樣方法。2020ACCP認為TBCB是SLB的合理替代方案，可為ILD多學科討論提供組織病理信息[16]。

本研究團隊采集了年齡、性別、體質量、身高、吸煙狀態、活檢位置、標本大小、活檢次數等患者特征，比較這些特征與出血的關系。單因素χ2檢驗表明，身高≥161.58 cm的患者發生出血風險高于身高＜161.58 cm的患者（P=0.013），男性比女性發生出血風險高（P=0.023）。進一步采用Logistic 回歸分析發現，身高（OR=8.679，95%CI=1.646～45.762）可能增加TBCB出血的風險。HETZEL等[4]發現老年（≥65歲）、女性、矮小（≤170 cm）的患者在TBCB時更容易出血，然而本研究未發現這些特征，可能原因在于人種差異、研究操作設計不同和樣本量偏少。低臨床出血組和高臨床出血組，在術后住院時間上無差異，但同時也注意到，有14例患者在術后1 d出院，這是否暗示了未來在門診或者日間開展TBCB的可能。

在眾多報道[4，15，17]中發現，采用術中X線透視技術來確定TBCB探頭與胸膜的位置進行定位，優點在于讓操作者直觀感受TBCB探頭所在位置，缺點在于支氣管樹呈三維結構，顯示二維結構的X線透視需要多角度調整曝光位置，有條件者可采用錐形束CT（cone beam CT,CBCT）改變這一缺點；但都增加了患者和術者的輻射暴露風險。本研究團隊采用ROSE與R-EBUS技術相結合的方式來輔助TBCB。REBUS可顯示支氣管周圍血管，避免在較大血管周圍行TBCB，降低出血風險；同時，R-EBUS顯示密集征象更加提示在病灶周圍。在一項多中心前瞻性研 究[17]，納入了87例DPLD患者，49例行R-EBUS指導下TBCB，R-EBUS顯示密集征象患者的肺標本病理學置信度高于暴風雪征象的患者（P＜0.01）和未行REBUS的患者（P＜0.05）。與未行R-EBUS的患者相比，行R-EBUS的TBCB患者有著更低的支氣管出血風險和更短的手術時間（P＜0.01）。當前，ROSE主要見于報道鑒別惡性病變上，鮮少報道應用于ILD診斷方面。本團隊采用ROSE，觀察TBCB標本的細胞類型，注意纖毛、上皮細胞成分和比例，注意觀察非上皮細胞成分（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞、組織細胞、多核巨細胞、類上皮細胞等），從細胞層面推測TBCB活檢的深度和是否取到病變組織，及時反饋給術者。最終，本團隊將52例DLD患者結合病史、影像、血清學及病理進行了分類，只有2例歸類于不能分類的IIP，其余50例DLD得到了臨床病理診斷，診斷率為96.15%。在安全性上，沒有或極少量出血：20例（38.46%），輕度出血：21例（40.38%），中度出血：11例（21.15%），沒有重度出血，這與HETZEL等[4]的報道相近；氣胸的發生率為3.85%，低于DAVIDSEN等[14]的報道，這可能與本研究的樣本量少，冷凍探頭的型號與冷凍時間有關。2例輕度氣胸患者分別在術后4 d、6 d出院；1例急性左心衰經利尿等治療后好轉出院，1例低氧血癥經無創續貫后恢復，術后1 d出院；所有患者的中位術后住院時間為6（1，6）d；所有患者均未發生需入住ICU的嚴重不良事件；在嚴重不良事件發生率上與RAVAGLIA等[13]的報道相符；在術后住院時間上要多于RAVAGLIA等[13]的報道，但本研究中術后 1 d出院患者有14例（26.92%），說明差別可能是由于診療管理的差異造成而非TBCB引起。標本平均大小為（13.69±4.72）mm2，這與SRYMA等[15]的報道相近。

本次研究的不足之處為回顧性分析，單臂型數據，病例的樣本量少且不均衡，可能使結果產生偏倚。

綜上所述，聯合應用ROSE與R-EBUS于TBCB在DLD診斷中具有一定的可行性和安全性。