姜黃素調控LncRNA MEG3/miR-21/PTEN通路促HPV陽性宮頸癌細胞凋亡

黃穎，史耀琪，胡佳明，倪新雨，朱華

溫州醫科大學附屬第一醫院 婦科，浙江 溫州 325015

宮頸癌為全世界女性中第四大常見癌癥，嚴重危害著當代女性的健康[1]。宮頸癌的主要致病因素是高危型乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus,HR-HPV）的感染[2]。雖然商業化應用的HPV疫苗可以預防宮頸癌，但是已感染HPV的患者數量眾多，而不發達國家HPV疫苗接種率偏低，因此宮頸癌的發病率仍然高居不下。臨床上對宮頸癌的治療主要依賴手術、放療、化療等方法，不良反應較強。

中藥以其天然、不良反應小的獨特優勢被越來越多地應用到抗腫瘤領域中，部分中藥已被美國FDA批準進入臨床試驗[3]。姜黃素是從姜科植物的根莖中提取的酚類色素，呈橙黃色結晶粉末狀，氣香特異，味微苦、辛，在傳統中醫中有很大的藥用價值，主治胸脅刺痛，胸痹心痛，痛經經閉，癥瘕，風濕肩臂疼痛，跌撲腫痛等疾病。近年來，越來越多的研究發現了姜黃素的抗腫瘤作用，包括抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯腫瘤細胞周期、抑制腫瘤侵襲和轉移等[4-6]。

本課題組前期預實驗結果表明，姜黃素對HPV陽性宮頸癌細胞具有殺傷作用，并且姜黃素可以上調HPV陽性宮頸癌細胞中LncRNA MEG3的表達水平。研究表明，LncRNA MEG3能夠抑制多種癌癥的發生發展[7-10]，而且LncRNA MEG3能夠抑制miR-21的表達[7，11]。本研究旨在探討姜黃素殺傷HPV陽性宮頸癌細胞與LncRNA MEG3的上調表達的相關性以及具體的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株、載體與主要試劑：HPV16陽性宮頸癌SiHa細胞株購自中國科學院細胞庫；α-MEM培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等細胞培養試劑購自美國Gibco公司；姜黃素（純度＞98%）購自上海源葉生物科技有限公司；Lipofectamine 2000、TRIzol購自美國Invitrogen公司；LncRNA MEG3 siRNA委托上海吉瑪制藥技術有限公司合成；反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒及引物的設計和合成委托大連TaKaRa公司完成；CCK-8細胞活性檢測試劑盒、Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；PTEN單克隆抗體和活化的caspase3 單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；其他常用試劑購自美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器：Real time PCR分析儀購自美國ABI公司；流式細胞儀購自美國Backman公司；電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及姜黃素處理：SiHa細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的α-MEM培養基，于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫細胞培養箱中進行常規培養。取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2 細胞活性檢測：將處于對數生長期的SiHa細胞接種于96孔板上，5×103個/孔。接種24 h后，以50 μmol/L[12]姜黃素處理細胞24、36、48、72 h后，用CCK-8法檢測姜黃素對SiHa細胞活性的影響，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于37 ℃繼續孵育2 h，再用酶標儀檢測450 nm處吸光度。以二甲基亞砜（DMSO）處理相同時間點的細胞作為對照組。

1.2.3 細胞凋亡檢測：將處于對數生長期的SiHa細胞接種于6孔板，2×103個/孔。接種24 h后，更換含有終濃度為50 μmol/L姜黃素的培養基繼續培養36 h，然后將細胞用0.25%的胰蛋白酶消化并收集，冷的PBS洗滌2遍后，用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒染色30 min，用流式細胞儀進行檢測。流式檢測的結果用FlowJo10.6.2軟件進行分析。以DMSO處理相同時間的細胞作為對照組。

1.2.4 SiRNA干擾LncRNA MEG3基因的表達：將處于對數生長期的SiHa細胞接種于6孔板，1×106/孔。接種24 h后，利用Lipofectamine 2000按照標準步驟將LncRNA MEG3轉染進入細胞。將轉染NC siRNA的細胞作為對照組。

1.2.5 實時定量PCR：將處于對數生長期的SiHa細胞接種于6孔板，1×106/孔。接種24 h后，更換含有終濃度為50 μmol/L姜黃素的培養基繼續培養24、36、48、72 h后，采用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA，每樣品取1 μg總RNA反轉錄合成cDNA，用cDNA作為模板進行目的基因擴增，采用GAPDH作為內參基因。反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。LncRNA MEG3基因的上游引物序列為：5’-GCTATGCTCATACTTTGACT C-3’；下游引物序列為5’-CATCATAAGGGTGATGACAG-3’。miR-21上游引物序列為：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTAA ACATCCTACACTCT-3’；下游引物序列為5’-CTCAACTGG TGTCGTGGA-3’。以DMSO處理相同時間的細胞樣品作為對照組。

1.2.6 蛋白質印跡法（Western blot）：將處于對數生長期的SiHa細胞接種于6孔板，1×106個/孔。接種24 h后，更換含有終濃度為50 μmol/L姜黃素的培養基繼續培養48 h后，裂解細胞提取總蛋白，總蛋白經SDS-PAGE電泳分離后轉移到PVDF膜，將PVDF膜用5%的脫脂牛奶于4 ℃封閉過夜，一抗于37 ℃ 孵育1.5 h后，TBST洗滌5次后，HRP標記的二抗于37 ℃繼續孵育1 h。TBST洗滌5次后，用ECL發光試劑曝光膜上的條帶。以DMSO處理相同時間的細胞作為對照組。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素顯著促進宮頸癌SiHa細胞凋亡 與對照組相比，隨著姜黃素處理時間增加，SiHa細胞的活力逐漸下降，并且從36 h開始，姜黃素組與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01），隨著處理時間 延長細胞活力不斷降低，到72 h達到最低。見圖1。

圖1 姜黃素顯著降低宮頸癌SiHa細胞活力

用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細胞 72 h后進行細胞凋亡檢測。與對照組相比，姜黃素組的細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），見圖2。

圖2 姜黃素顯著促進宮頸癌SiHa細胞凋亡

2.2 姜黃素促進宮頸癌SiHa細胞凋亡的相關因子檢測 用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細胞72 h后，與對照組相比，姜黃素組lncRNA MEG3的表達水平顯著升高（P＜0.01），見圖3A。與對照相 比，經姜黃素處理的細胞中miR-21的表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖3B。

用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細胞 72 h后，與對照組相比，姜黃素組細胞中PTEN的表達水平顯著升高（P＜0.01）。與對照組相比，姜黃素組細胞中Cleaved caspase3的水平顯著升高（P＜ 0.01）。見圖3C。

圖3 姜黃素促進宮頸癌SiHa細胞凋亡的相關因子檢測

2.3 敲低表達LncRNA MEG3抑制了姜黃素對SiHa細胞的促凋亡作用 將SiHa細胞利用siRNA進行LncRNA MEG3敲低表達，見圖4A。用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細胞72 h后進行細胞凋亡檢測。轉染LncRNA MEG3 siRNA后，對照組和姜黃素組的細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05），而轉染NC siRNA后，姜黃素組細胞凋亡率明顯高于對照組（P＜0.01）。見圖4B。

圖4 敲低表達LncRNA MEG3抑制了姜黃素對SiHa細胞的促凋亡

2.4 敲低表達LncRNA MEG3逆轉了姜黃素對miR-21和PTEN的影響 將SiHa細胞利用siRNA進行LncRNA MEG3敲低表達后用50 μmol/L的姜黃素處理宮頸癌SiHa細胞72 h，提取總RNA進行實時定量PCR檢測miR-21表達水平。轉染LncRNA MEG3 siRNA后，姜黃素組與對照組之間miR-21表達水平差異無統計學意義 （P＞0.05），而轉染NC siRNA后，姜黃素組miR-21表達水平與對照組相比顯著下降（P＜0.01）。見圖5A。轉染LncRNA MEG3 siRNA后，姜黃素組和對照組之間PTEN和Cleaved caspase3的表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），而轉染NC siRNA后，姜黃素組PTEN和活化的Cleaved caspase3表達水平與對照組相比都顯著升高（P＜0.01）。見圖5B。

圖5 敲低表達LncRNA MEG3能夠逆轉姜黃素對miR-21、PTEN和Cleaved caspase3的調控

3 討論

宮頸癌作為世界女性第四大癌癥[1]，其發病的主要原因是HR-HPV的持續感染[2]。然而，HPV感染自身不足以引起宮頸癌前病變和宮頸癌，宿主因素也是必不可少的[13-14]。

近年來很多研究表明，姜黃素具有抗多種腫瘤的效果[15]。此外有研究[16]發現，LncRNA作為一種不編碼蛋白的RNA分子，具有潛在的復雜多樣的生物功能，參與癌癥的發生發展過程，而且與多種藥物的抗癌機制密切聯系。筆者前期的預實驗結果表明，姜黃素能夠殺傷HPV陽性宮頸癌細胞，并且能上調LncRNA MEG3的表達水平。本研究繼續探索了姜黃素殺傷HPV陽性宮頸癌細胞的機制以及上調表達的LncRNA MEG3在該殺傷過程中的作用。

與筆者之前的結果相一致，細胞凋亡檢測實驗結果表明，姜黃素能夠顯著促進HPV16陽性宮頸癌SiHa細胞的凋亡，而且姜黃素能夠顯著上調LncRNA MEG3的表達。LncRNA MEG3在多種癌癥中作為抑癌因子發揮作用[7-10]，而且過表達的LncRNA MEG3能夠抑制miR-21的表達[7，11]。本研究結果也表明，姜黃素能夠顯著下調HPV16 陽性宮頸癌SiHa細胞中miR-21的表達。據報道，miR-21能夠與PTEN的3’-UTR結合，抑制PTEN的表達[17-18]，而PTEN能夠調節PI3K/Akt等信號通路促進細胞凋亡[19]。本結果顯示，姜黃素顯著上調了PTEN和活化的caspase3的表達。據此，筆者推測姜黃素有可能通過上調LncRNA MEG3而降低miR-21的表達，從而上調PTEN和活化的caspase3的表達，最終促進HPV16陽性宮頸癌細胞的凋亡。筆者通過LncRNA MEG3表達干擾實驗結果證實了這種假設。干擾宮頸癌細胞中LncRNA MEG3的表達抑制了姜黃素引起的細胞凋亡現象，逆轉了姜黃素引起的miR-21、PTEN和活化的caspase3等表達水平變化。

本研究發現了姜黃素能夠激活LncRNA MEG3/miRNA-21/PTEN信號通路，促進宮頸癌細胞凋亡，對于姜黃素治療宮頸癌具有重要理論意義。