hsa_circ_0001322在胃癌組織中的表達及其臨床意義

武文一，白永愉，莊曉鵬，蔡一奇，周珠哈，阮小蛟

溫州醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科，浙江 溫州 325015

環狀RNA（circular RNA,circRNA）是一種內源性非編碼RNA，通過反式剪接使3’端和5’端共價結合形成閉合的環狀結構，具有高度穩定性、生物進化保守性和組織表達特異性[1-2]。許多研究表明，circRNA不僅在轉錄翻譯等生物學進程中扮演重要角色[3-4]，且與腫瘤等多種疾病相關，影響癌細胞的增殖、分化、凋亡及轉移[5-10]。circRNA通過多種機制發揮作用，目前主流觀點認為circRNA的主要功能是通過作為微小RNA（microRNA,miRNA）的分子海綿來實現，通過影響miRNA的表達，導致miRNA靶基因的變化[5，11]。胃癌是我國常見的惡性腫瘤，是世界第三大癌癥死亡原因[12]，有易轉移、預后差等特點，而circRNAs在胃癌的進展中起到了重要調節作用。hsa_circ_0001322由EIF4E3基因的外顯子3-8反向剪接形成，我們前期研究發現hsa_circ_0001322在胃癌組織中表達明顯降低，但其與胃癌臨床病理特征的關系尚未見報道。本研究采用實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）對54例胃癌組織及配對癌旁正常胃黏膜組織hsa_circ_0001322的表達水平進行檢測，分析其與胃癌臨床病理特征的關系，探討其在胃癌發生發展中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器 TRIzol試劑和RNase-free water購自美國Life Technologies公司；5×Prime Script RT Master Mix和SYBR qPCR Master Mix購自日本Takara公司；RT-qPCR儀購自德國 Analytikjena公司。

1.2 方法

1.2.1 標本收集：選取2019年10月至2020年4月在溫州醫科大學附屬第一醫院胃腸外科行手術治療的胃癌患者54例，年齡44～82（72.0±4.7）歲。再選取2020年2月至2020年5月我院胃癌患者24例作為驗證集，年齡54～76（69.4±3.1）歲。所有患者術前未行放、化療等治療，組織病理類型及分期的判斷由本院病理科醫師按世界衛生組織胃癌的組織學分型國際分類法（1979年）和美國癌癥聯合會第八版標準出具病理報告。每例標本留取腫瘤組織及對應的距腫瘤6 cm以上的癌旁正常胃黏膜組織，離體后10 min內置于液氮保存待做后續分析。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2.2 總RNA提取：取適量組織進行液氮研磨（研缽先高壓高溫滅菌處理），將粉末轉移至預先裝有1 mL TRIzol的EP管中，充分震蕩混勻。取0.2 mL氯仿于上述EP管中，充分震蕩3 min，冰上靜置 5 min，4 ℃離心12 000 r/min，15 min。吸取上層水相至新的RNase-free EP管中，加入0.6 mL異丙醇，混勻，-20 ℃放置30 min。置入離心機，12 000 r/min， 4 ℃離心30 min，棄上清液，觀察是否有沉淀。沿管壁加入1 mL預冷的75% DEPC水配制乙醇，輕輕上下顛倒，洗滌離心管。再次置入離心機4 ℃， 7 500 r/min，離心5 min，棄去液體（盡量吸干）。室溫干燥5 min，加入40 μL RNase-free水溶解，230 nm處檢測RNA濃度，-80℃保存。

1.2.3 RT-qPCR檢測：采用RT-qPCR方法，以GAPDH 作為內參，分析hsa_circ_ 0001322表達，相關引物序列見表1。2 μg總RNA分別以hsa_circ_0001322及GAPDH引物進行反轉錄，反應條件為：37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 min，反應結束后4 ℃保存。以20 μL反應體系進行RT-qPCR。檢測反應體系包括：10 μL SYBR qPCR Master Mix，0.5 μL circRNA特異前向引物、0.5μL特異反向引物，1 μL cDNA，8 μL ddH2O。RT-qPCR條件為：在95 ℃下預變性5 min，然后在 95 ℃下30 次變性30 個循環，60 ℃退火30 s，在 72 ℃延伸30 s，最后延伸在72 ℃下放置7 min。所有樣品做兩個復孔。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數即Ct值，以GAPDH作為內參照，采用RT-qPCR中的相對定量法，以2-ΔΔCt表示腫瘤組織目的基因的表達相對于配對的癌旁正常胃黏膜組織的變化倍數，其中ΔΔCt= （Cthsa_circ_0001322-CtGAPDH）腫瘤-（Cthsa_circ_000132-CtGAPDH）正常。癌旁正常胃黏膜組織的基因表達值為1。

表1 circRNA RT-qPCR檢測相關引物序列

1.3 統計學處理方法 采用SPSS23.0軟件進行分析。hsa_circ_0001322相對表達值不符合正態分布，以M（P25，P75）表示，胃癌及配對癌旁正常胃黏膜組織間比較采用配對Wilcoxon符號秩檢驗比較，兩獨立樣本間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskall-Wallis檢驗。采用偏相關分析探討胃癌組織hsa_circ_0001322的表達量（相對于GAPDH的ΔCT值，經檢驗符合正態分布）在去除各影響因素后與淋巴結轉移的相關性。采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve,ROC曲線）分析胃癌組織中hsa_circ_0001322的相對表達量對判斷胃癌組織有無淋巴結轉移的效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌及配對癌旁正常胃黏膜組織中hsa_circ_ 0001322的表達 RT-qPCR結果表明，與配對癌旁正常胃黏膜組織比較，胃癌組織中的hsa_circ_ 0001322相對表達量明顯降低，差異有統計學意義 （P＜0.05）。見圖1。

圖1 hsa_circ_0001322在胃癌組織相對癌旁正常胃黏膜組織的表達情況

2.2 hsa_circ_0001322表達與胃癌臨床病理特征的關系 高分化組的胃癌組織中hsa_circ_0001322的相對表達量明顯高于低分化組，無淋巴結轉移組中hsa_circ_0001322的相對表達量明顯高于有淋巴結轉移組（P＜0.05）。另外，不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、淋巴結轉移分期及TNM分期間胃癌組織中hsa_circ_0001322的相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 胃癌中hsa_circ_0001322表達和臨床病理特征的關系

2.3 hsa_circ_0001322與胃癌淋巴結轉移的相關性分析 胃癌的淋巴結轉移受患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度、細胞分化程度等多因素影響，我們采用偏相關分析排除這些影響因素后判斷hsa_circ_0001322是否與胃癌的淋巴結轉移狀態相關。結果顯示，無論患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度和細胞分化程度如何，hsa_circ_0003122的表達量與胃癌的淋巴結轉移存在負相關性（r=-0.587，P＜0.05）。

2.4 ROC曲線分析hsa_circ_0001322預測胃癌淋巴結轉移的敏感度和特異度 ROC曲線分析結果顯示，曲線下面積（area under curve,AUC）為0.808（95%CI=0.684～0.933，P＜0.05），以hsa_circ_ 0001322相對表達量0.254作為截斷值判斷胃癌有無淋巴結轉移的敏感度和特異度分別為90.0%和75.0%，見圖2。

圖2 hsa_circ_0001322判斷胃癌淋巴結轉移的效能

為進一步分析hsa_circ_0001322 預測胃癌淋巴結轉移的效能，我們另外選取24 例胃癌患者作為驗證集，仍以hsa_circ_0001322 相對表達量0.254作為截斷值，對胃癌有無淋巴結進行預測并與手術后病理報告（有淋巴結轉移14例，無淋巴結轉移10例）對比。ROC曲線分析顯示，AUC為0.757（95%CI=0.542～0.972，P＜0.05），敏感度和特異度分別為85.7%和80.0%。見圖3。

圖3 hsa_circ_0001322預測胃癌淋巴結轉移的效能

3 討論

我國是全球胃癌發病率最高的國家，五年存活率僅為27.4%。雖然隨著胃鏡篩查的普及[13]、手術方式的改良以及輔助放化療的綜合診治手段的推廣，胃癌患者的預后和生活質量已經有了較大的提升[14]，但胃癌的預防和診治仍面臨著許多挑戰。胃癌早期患者經及時治療后的生存率可以達到90%～95%，但是由于此時病灶小、較隱秘，且患者癥狀不明顯，易被誤診或者漏診，確診時已發展成中晚期胃癌，所以早期胃癌的診斷意義重大，但是現在對于臨床癥狀不明顯，影像學不典型的早期胃癌患者還沒有非常經濟可靠的檢測手段。另外，淋巴結轉移是影響胃癌患者預后的重要因素，局部病灶切除加區域淋巴結清掃是治療胃癌的標準術式。但是淋巴結清掃也伴隨著更高的手術并發癥發生率以及病死率，并且臨床上常常也因淋巴結清掃范圍盲目擴大，而嚴重影響手術療效。因此準確判斷胃癌淋巴結轉移是精確手術治療胃癌的前提，現在主流的影像學分析技術雖已經獲得了極大進步，但是仍達不到完全有效的程度，容易漏診或難以判斷[15]，仍亟待其他技術手段的輔助。

隨著分子生物學的發展，腫瘤標志物在癌癥篩查及診斷中發揮了越來越重要的角色，結合特異性腫瘤標志物的聯合診斷方法具有更好的便捷性和更高的準確度。circRNAs是非編碼RNA的一種特殊類型，與傳統的線性RNA不同，circRNAs因其具有環狀結構可以抵抗外切酶和RNA酶的降解，因而在細胞中可以相對穩定存在[16-17]。研究發現circRNAs可以作為分子海綿吸附miRNAs抑制其功能進而調控癌癥的發展：如circ-TTBK2通過ceRNA機制調節miR-217/HNF1β/Derlin-1 軸促進神經膠質瘤進展[18]；circEYA3通過海綿作用吸附miR-1294調節c-Myc表達進而促進胰腺導管腺癌的進展[19]；circCCDC9通過調節miR-6792-3P/CAV1軸抑制胃癌的進展[20]。同時MA等[21]報道hsa_circ_0004872通過調節miR-224/Smad4/ADAR1通路影響胃癌的淋巴結轉移。另外cicrRNA的表達具有非常強的組織特異性，同時其在直腸癌、肝癌以及胰腺癌等癌癥中都表現出明顯的異常表達現象[22]。以上功能特征使得cicrRNA具有作為有效診斷癌癥的特異性標志物的潛力。

本研究檢測了54 例胃癌患者的胃癌組織以及配對的癌旁正常胃黏膜組織中的hsa_circ_0001322的表達情況。有趣的是54 例胃癌患者的胃癌組織相對于癌旁正常胃黏膜組織中hsa_circ_0001322的表達量皆出現了明顯下降，同時臨床病理特征關聯分析表明其下降在胃癌的各種病理特征分類下都具有一致性，說明此下降現象與胃癌病變有直接的強關聯。這說明癌變的發生會伴隨著組織中hsa_circ_0001322表達量的下降，且這種變化趨勢的穩定性較好。這些變化特征使得hsa_circ_0001322具有作為胃癌診斷的生物標志物的潛力。通過病理特征關聯分析發現在是否發生淋巴結轉移的病例分組中hsa_circ_0001322的相對表達量差異有統計學意義，另外除分化程度外，其他病理特征分組的hsa_circ_0001322相對表達量差異無統計學意義，說明其在胃癌組織中的進一步變化與淋巴結轉移具有相關性，進一步偏相關分析結果顯示排除患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤浸潤深度和細胞分化程度后，hsa_circ_0003122的表達量與胃癌的淋巴結轉移存在負相關性。hsa_circ_0001322這種變化特征使得它具有作為指示胃癌細胞淋巴結轉移生物標志物的潛力。ROC曲線分析結果顯示，AUC為0.808，當hsa_circ_0001322的相對表達量為0.254時，其預測淋巴結轉移的敏感度和特異度分別為90.0%和75.0%；本研究繼續選取24例胃癌患者驗證ROC曲線的效能，其AUC為0.757，敏感度和特異度分別為85.7%和80.0%，其在預測胃癌淋巴結轉移方面可能具有一定的潛力。

但是本研究尚有一些需要完善的地方，首先我們是從病理樣本中檢測hsa_circ_0001322的表達變化，這在一定程度上限制了檢測的便捷性，可以進一步統計分析血清中hsa_circ_0001322的表達變化，以觀察其規律。其次，臨床病例分析發現多種生物標志物聯合使用，可以增加預測的準確度，我們可以進一步探索hsa_circ_0001322與其他生物標志物，如SLP1、PG等，聯合分析是否可以增加預測淋巴結轉移的準確度。再次本研究的樣本量較少，如針對更廣泛的患者，這種規律是否會保持一致，也需要探討的問題。