子宮內膜異位癥相關巨噬細胞的提取和鑒別

陳賽玲，王芳，陳慧倩，胡雪莉，吳妹玲，段萍

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 婦產科，浙江 溫州 325027

子宮內膜異位癥（endometriosis,EMs）是具有盆腹腔局部免疫功能異常的婦科常見病。其中，巨噬細胞是含量最多的免疫細胞。此外，EMs相關巨噬細胞（endometriosis-associated macrophages,EAMs）的M2表型被發現在EMs患者異位病灶中占主導地位，可分泌相關炎癥因子，而炎癥因子之間動態相互作用的失調可導致逆流子宮內膜碎片逃脫免疫清除并在異位種植生長，其中免疫起著關鍵性作用。那么如何從EMs病灶中分離、提純巨噬細胞是深入進行EMs免疫相關體外研究的關鍵，目前國內外鮮見關于EAMs提取方法的報道。本研究擬利用酶消化法和密度梯度離心法分離EAMs，并進行貼壁培養和鑒定，探討此法提取EAMs的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本：本研究免疫組織化學組織切片均取自溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院病理科，選取7個EMs患者的異位病灶（卵巢、膀胱壁、腹壁、腹直肌、盆腔等）；7個正常內膜組織（宮頸上皮內瘤變II-III級）作為對照。原代細胞提取3例EMs病灶標本均取自于溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院婦科，經腹腔鏡以及病理確診為EMs的異位病灶組織。用于免疫組織化學的病理切片人體組織標本已通過醫院倫理委員會審批且取得患者的知情同意。

1.1.2 試劑：免疫組織化學抗體CD68、CD163購自美國Abcam公司；免疫組織化學檢測試劑兔二步法試劑盒、DAB顯色液購自北京中衫金橋公司，山羊血清、枸櫞酸鈉緩沖液均購自北京索萊寶公司；流式細胞檢測抗體Fc Receptor Blocking Solution LIVE/DEAD-APC/Cy7、CD11b-APC、CD163-PE、CD80-PE/Cy7抗體均購自美國Biolegend公司；用于原代細胞培養的膠原酶（Type IV）購自德國Worthington公司，透明質酸酶、DNA酶、組織淋巴細胞分離液試劑盒（主要包括各種組織淋巴細胞分離液、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液）購自北京索萊寶公司；RPMI1640培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色：將獲得的標本制成厚度2 μm的切片，用酶標抗體法進行檢測。首先在室溫下進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇依次脫水、枸櫞酸鈉修復、3%過氧化氫滅活內源酶，然后分別滴加CD68、CD163一抗（1:200）進行孵育，放入濕盒內 4 ℃孵育過夜。第2天，37 ℃復溫30 min，用PBS洗掉一抗，滴加酶標羊抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育40 min，PBS沖洗3次，滴加適量新鮮配制的二氨基聯苯胺（DAB）染色1 min，蘇木素復染5 s，鹽酸乙醇分化，最后沖洗返藍，脫水透明，封片。

1.2.2 原代EAMs的分離提取：EMs患者手術切除病灶，新鮮組織離體之后盡快（＜2 h）分離培養。每例EMs異位病灶取長徑為4～6 cm，采用篩網過濾分離EAMs。首先用含1%青鏈霉素的無菌PBS清洗異位病灶3遍，去除血污，剪碎至直徑＜1 mm3的乳糜狀組織。在RPMI 1640培養基中加入0.1% IV型膠原酶、0.02%透明質酸酶、0.004% DNA酶混勻，最終配制成混合消化酶溶液。將組織與混合消化酶按1:3的體積比例放置37 ℃水浴鍋消化40～60 min，每10 min混勻顛倒，直至組織呈膠凍狀。再將細胞經過100目篩網過濾一次，濾去殘余組織，得到單細胞懸液，然后加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養液終止消化。取一支適當的離心管，加入與單細胞懸液等量的分離液。吸取過濾過的單細胞懸液平鋪于分離液液面上，過程始終保持兩液面界面清晰。室溫，以500～900×g離心20～30 min。離心后，可見離心管中由上至下細胞分四層。分別為：稀釋液層、乳白色淋巴細胞層、透明分離液層、紅細胞層，用吸管小心吸取第二層環狀乳白色淋巴細胞至另一潔凈的離心管中，向離心管中加入細胞洗滌液洗滌白膜層細胞，250×g，離心10 min。最終用RPMI 1640完全培養基重懸細胞，分離所得細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。2～4 h后換液，此后每隔2 d換液，每日用倒置顯微鏡直接觀察細胞形態和細胞生長情況。待細胞生長鋪滿80%細胞皿后，即可傳代。

1.2.3 流式細胞儀鑒定EAMs：收集貼壁培養的原代巨噬細胞，吸去培養液，用0.25%胰酶消化后，細胞存于離心管中，每管細胞數量不少于1×106個/mL， 1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，然后加入 100 μL的PBS制成單細胞懸液，加入FcX抗體封閉，冰上避光孵育30 min，預冷PBS洗滌后加入2.5 μL的CD163、CD11b抗體標記巨噬細胞特異標志蛋白，冰上避光孵育30 min，PBS洗滌2次后1 000 r/min離心3 min，去掉上清液，加入500 μL PBS，重懸，用BECKMAN COULTER流式細胞儀檢測巨噬細胞表面抗原表達。具體分為以下幾組：空白組，CD11b單染色組，CD163單染色組，CD80單染組以及CD11b、CD163、CD80三染組。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0統計軟件進行Two-tailed Student’st檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 M2細胞表面標志物在EMs上高表達 本研究選取7個EMs患者的異位病灶，7個正常內膜組織作為對照。以CD68為巨噬細胞表面共同分子標志物，CD163為M2細胞表面標志物[1]，通過免疫組織化學檢測可見在單個視野下的陽性細胞，檢測分為正常內膜組（En）、EMs病灶組（Ec）。在異位病灶間質組織中可見陽性表達（棕黃色），見圖1A-F。其中，CD68分布在細胞膜表面，CD163分布在胞漿和胞膜，見圖1C、圖1F。EMs病灶組CD68和CD163的表達均高于正常內膜組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1G、圖1H。

圖1 IHC法檢測正常子宮內膜（En）、EMs異位病灶（Ec）巨噬細胞表面抗體表達

2.2 EMs組織提取巨噬細胞 通過淋巴細胞分離液分離EAMs，密度梯度離心法后發現消化液明顯分層，見圖2。

圖2 EAMs離心分層圖

2.3 EAMs形態學觀察 鏡下觀察到EAMs呈橢圓形，并有短小突起，還有伸出較長偽足而呈不規則形，表明功能活躍，見圖3。

圖3 倒置顯微鏡下原代EAMs的形態

2.4 流式細胞術檢測EAMs的表達情況 收集貼壁生長的原代巨噬細胞，經流式細胞術檢測CD11b、CD163以及CD80的表達，CD11b+、CD163+為M2標志特征，CD11b+、CD80+為M1標志特征。結果顯示CD11b單陽性比例為73%，CD11b和CD163雙陽性比例為6.46%，而CD11b、CD80雙陽性比例為0，可得出EMs病灶中巨噬細胞以M2表型為主導。見圖4。

圖4 流式細胞術檢測EAMs表面抗原CD11b、CD163和CD80的表達水平

3 討論

近年研究表明，巨噬細胞是EMs腹腔液中數量最多的免疫細胞，在EMs的發生、發展過程中發揮關鍵作用，主要參與細胞凋亡、炎癥消退、組織修復和傷口愈合等[2-4]。巨噬細胞被招募到EMs微環境中并浸潤于異位病灶中，這些巨噬細胞分泌各種局部產物[5]，如生長因子和細胞因子，導致其吞噬能力受損、凋亡增加，形成相對免疫耐受的微環境，有助于EMs細胞的存活[6]?？梢姡奘杉毎δ艿母淖兪荅Ms免疫耐受形成的基礎性因素。人們已廣泛研究EMs免疫微環境中巨噬細胞在不同內膜周期特征以及變化，但目前國內外鮮見EAMs概念及其提取方法的提出或報道。2017年WOO等[7]首次提出EAMs的概念，由人異位子宮內膜細胞（間質細胞和上皮細胞）條件介質培養基誘導培養原始巨噬細胞（M0）而得，但此法無法實現整個EMs免疫微環境（包括各種細胞和炎癥因子）對M0的作用，因此亟需一種EMs異位病灶巨噬細胞分離提取的方法。

巨噬細胞在EMs中根據激活狀態和表面標記的不同主要分為經典激活的M1和選擇性激活的M2，這種表型的可塑性可由EMs微環境改變引起[8-9]。例如，EMs患者盆腔中存在促炎和抗炎因子混合表型以及平衡失調，由此導致局部免疫功能障礙，EMs病灶中巨噬細胞向M2極化，使得M1吞噬清除影響下降，表現出較差的吞噬能力，并且浸潤EMs病灶，促進血管生成[10-11]。其中，M2被認為是抗炎細胞，參與組織修復、血管生成、神經發生和組織的上皮間質轉化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）[12]，即子宮在位內膜受到巨噬細胞分泌的炎癥因子影響發生EMT獲得遷移侵襲能力，并進一步在M2極化相關炎癥因子促進下種植到盆腹腔發生黏附、侵襲、血管新生及神經新生，形成異位病灶即子宮內膜樣組織利用缺陷的盆腹腔微環境來實現自身的浸潤生長[13]。有研究表明，腹腔和異位病變中M2的增加有助于病灶的形成和提供允許生長的抗炎環境[1，14]。CD68是巨噬細胞共同表面標志物，能同時識別M1和巨噬細胞，CD163是清道夫受體超家族重要成員，主要表達于單核細胞和巨噬細胞表面，被認為是一種高特異性的M2型巨噬細胞標志物[15]。本研究利用CD68和CD163作為M2巨噬細胞的標志 物[16]，發現2型巨噬細胞在EMs病灶中高表達，符合上述文獻報道。

目前已有多種組織和器官的巨噬細胞分離培養、鑒定方法，主要包括Percoll法、Ficoll-Hypaque 分離法、差速貼壁分離法等[17-19]。李莉等[17]利用機械法和酶消化法相結合制備小鼠子宮組織單細胞懸液，通過密度梯度離心初步分離巨噬細胞，WOO等[7]從異位子宮內膜細胞中獲取條件培養液，將其加入佛波酯誘導THP-1細胞分化為M0后的原始巨噬細胞中，誘導分化得到EAMs。孟凡榮等[19]通過取小鼠脛骨和腓骨骨髓，提取小鼠骨髓細胞，通過巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor,M-CSF）、脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）、γ-干擾素（interferon-γ,INF-γ）和白細胞介素-4（interleukin-4,IL-4）刺激，體外誘導分化得到M1型和M2型巨噬細胞。但上述方法具有細胞純度低、特異性差、無法增殖培養等缺點。綜上，EAMs之所以難以分離培養，主要在于EMs病灶總體細胞所占比例相對較少，因此有效分離去除子宮上皮組織及其他細胞是分離EAMs的關鍵。本研究利用機械法結合消化酶法分離EAMs，然后使用組織巨噬細胞分離液，利用細胞之間的比重差異對不同細胞進行分層，再根據EAMs黏附能力強、2～4 h內貼壁的特性，將巨噬細胞與間質細胞、上皮細胞、成纖維細胞等貼壁細胞分開，進一步提高純度。對于分離得到的細胞，我們通過流式細胞檢測技術從形態學、特異性表面分子不同方面來進行鑒定。結果顯示通過酶消化法和密度離心法分離得到的巨噬細胞以M2表型為主，并且可穩定傳代，具有重要研究價值。本研究中的消化法與從其他器官組織中提取巨噬細胞方法對比有以下優點：①本膠原酶消化法結合機械法消化EMs病灶為首次提出，不同于傳統的炎癥因子誘導或者體外共培養，此法是真正存在于EMs病灶腹腔免疫微環境的，更貼合原始病灶巨噬細胞的特征。②病灶細胞復雜，含有上皮細胞、間質細胞和成纖維細胞等眾多細胞，我們采用密度梯度離心除去比重差別大的細胞，最終成功從復雜的細胞成分中提取出巨噬細胞。

原代巨噬細胞目前廣泛應用于眾多實體腫瘤的分子、細胞生物學和生物醫學基礎研究，還應用于藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。本研究利用CD80和CD163作為1型和2型巨噬細胞標志物[20]，采用的消化法可有效提取原代EAMs和擴充培養。雖然提取的是人EMs病灶組織，但此方法仍然適用于EMs動物模型，因此對進一步研究巨噬細胞在人和動物的EMs免疫微環境中發揮的作用特性及其生物學行為的影響具有重要價值。