口疳散穴位貼敷的制備工藝及體外透皮吸收研究*

李 清，周秋娟，瞿發(fā)林**，陳 穎，董文遷，樓欣譽(yù)

1 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇四醫(yī)院，常州 213003；2 常州市武進(jìn)區(qū)中西結(jié)合醫(yī)院，常州 213003；3 常州衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，常州 213003

口疳散穴位貼敷為本院中醫(yī)師自擬方，方中吳茱萸、細(xì)辛、生大黃、川黃連、肉桂研粉、以醋調(diào)勻，搓制成直徑1 cm 左右藥球，貼于雙足底涌泉穴，夜敷晝?nèi)ィ灾慰诏彲熜э@著。其中吳茱萸、細(xì)辛、肉桂為溫里藥，滋陰降火，導(dǎo)熱下行；大黃、黃連味苦性寒，清熱瀉火，用于上焦實火去炎。吳茱萸在本方中占比最大，其所含的主要成分是以吳茱萸堿為代表的生物堿類[1]，具有一定的透皮吸收性[2]。故本研究以吳茱萸堿為指標(biāo)成分，對不同制備工藝的口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的透皮吸收效果進(jìn)行比較，為穴位貼敷制備工藝的優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

TP-2A 型智能藥物透皮儀（河南佰澤儀器設(shè)備有限公司）；Waters2467 高效液相色譜儀（515 HPLC Pump 泵，Waters CapLC2487 雙λ 吸光度檢測器，Empower2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters 公司）；FA1004型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

吳茱萸堿對照品（南京世洲生物科技有限公司，純度：98%，批號：201901WZYJ）；大黃（批號：180923）、黃連片（批號：181221）、肉桂（批號：180807）、制吳茱萸（批號：181118）、細(xì)辛（批號：181118），均購自江蘇華洪藥業(yè)科技有限公司；聚乙二醇400（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20190806）；月桂氮卓酮（湖北科捷制藥有限公司，批號：181103）；甲醇為色譜純；白醋、生理鹽水為市售品；乙腈為色譜純；乙醇為藥用級；水為純化水。

1.3 實驗動物

SPF 級BALB/c 小鼠10 只，雄性，質(zhì)量（20±2）g（上海西普爾-必凱實驗動物有限公司）；動物合格證號：SCXK（滬）2018-0006。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Lichrospher C18（150×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（50∶50）；檢測波長：225 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液精密稱取吳茱萸堿對照品4.85 mg，置50 mL 量瓶中，用甲醇溶解，定容，搖勻，即得吳茱萸堿對照品儲備液（95.06 μg·mL-1）；取該溶按一定比例甲醇稀釋得對照品溶液。

2.2.2 實驗溶液①供試品透皮接收溶液：生理鹽水-乙醇-聚乙二醇400（6∶3∶1）；②透皮吸收樣液：在規(guī)定的時間內(nèi)從接受池中精密取樣1.0mL，用0.45μm的濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試品溶液；③皮膚滯留藥物樣液：24 h 體外透皮吸收實驗結(jié)束后，將皮膚取出，用新鮮接收液清洗表面殘留物，再用生理鹽水清洗干凈，用濾紙將其吸干，把有效滲透皮膚剪下并將其剪碎，加入1.0 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取2 次，每次30 min，用甲醇補(bǔ)足失重后取上清液，用0.45 μm 濾膜過濾，即得。

2.3 實驗分組

本實驗使用的藥材粉末分為兩種：一種是100目普通粉；另一種是500 目超微粉。實驗共分為7組。超微粉與普通組：分別將藥材的超微粉或普通粉按處方比例混勻后，加入適量的白醋調(diào)和成糊狀；水調(diào)和組：將藥材的超微粉按處方比例混勻后，加入適量的純化水調(diào)和成糊狀；不同比例氮酮組：將藥材的超微粉按處方比例混勻后，分別加入不同濃度氮酮（1%、3%、5%），加入適量的白醋調(diào)和成糊狀；陰性對照組：不含吳茱萸藥材的超微粉，按處方比例混勻，加適量白醋調(diào)和成糊狀。

2.4 專屬性考察

分別將對照品溶液、供試品透皮接收溶液和陰性樣品溶液按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，吳茱萸堿與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5，陰性樣品溶液對測定無干擾，該方法專屬性良好。見圖1。

圖1 吳茱萸堿的HPLC 圖

2.5 線性關(guān)系考察

取對照品貯備液按一定比例甲醇稀釋，得濃度分別為95.06、9.51、1.90、0.19、0.04、0.02 μg·mL-1系列對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：

Y=225 769X+51 885，r=0.999 9；表明吳茱萸堿在0.02～95.06 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計算得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.00%，表明儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一時間的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在0、3、6、9、12、18、24 h 進(jìn)樣，測定峰面積，計算RSD 為1.68%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗

精密量取適量空白透皮接收液6 份，分別加入適量的吳茱萸堿對照品溶液，混勻后用0.45 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率為98.40%，RSD 為1.79%。

2.9 體外透皮吸收實驗

2.9.1 離體鼠皮的制備將健康裸鼠脫臼處死后，小心剝離腹部皮膚；去除脂肪以及皮下組織，用生理鹽水洗凈，置于-20 ℃冰箱儲存[3]，使用前自然解凍，生理鹽水浸泡30 min，濾紙吸干后備用。

2.9.2 實驗過程采用改良Franz 擴(kuò)散池為透皮擴(kuò)散裝置：接受池體積為18 mL，接受面積為1.23 cm2，接受液為生理鹽水-乙醇-聚乙二醇400（6∶3∶1）。取3 份已經(jīng)處理好的裸鼠皮膚，裁剪成適當(dāng)大小，固定于接受池與供給池之間，皮膚角質(zhì)層面向供給池。在接受池中注滿接受液，轉(zhuǎn)速300 r·min-1，水浴溫度為（37±1）℃，排盡氣泡，平衡0.5 h。然后在供給池中分別加入0.65 g 按處方調(diào)制好的糊狀樣品并取不透光的紙箱，蓋住透皮擴(kuò)散裝置，以達(dá)到避光效果。在1、2、4、8、12、24 h 從接收池中取樣1 mL，同時加入1 mL 的新鮮等溫接受液。將取出的溶液用0.45 μm的濾膜過濾，取續(xù)濾液，即供試品透皮接受溶液。24 h 之后，將皮膚小心拿下，依據(jù)“2.2.2”項下的方法完成皮膚滯留藥物樣品。將之前得到的供試品透皮接受溶液以及后續(xù)制作的滯留藥物樣品，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)行吳茱萸堿的含量測定，并計算其累積透皮量[4]。

3 實驗結(jié)果

藥物的累積透皮量Qn可通過式（1）進(jìn)行計算：

Cn為第n 個取樣點(diǎn)測得的藥物質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；Ci為第i 個取樣點(diǎn)測得的藥物質(zhì)量濃度（μg·mL-1）；V 為接受液體積；Vi為取樣體積；S 為有效滲透面積[5]。以藥物的Qn（μg·cm-2）對取樣時間t（h）作曲線，并通過公式（2）對曲線中直線部分進(jìn)行線性回歸，求得直線斜率，即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Js（μg·cm-2·h-1）。

皮膚的藥物滯留量Qs（μg·cm-2）可按式（3）計算[6]：

A 為有效面積，V 為提取液的體積，C 為得到的藥物質(zhì)量濃度。

不同制備工藝的口疳散穴位貼敷，在體外透皮實驗的接收液中均檢測到了吳茱萸堿成分，各組吳茱萸堿的24 h 累積透皮量（Q24）如圖2 所示，其中超微粉組（5.43±0.17）μg·cm-2與普通粉組（3.71±0.10）μg·cm-2相比較，吳茱萸堿的Q24顯著性增加（P＜0.01）；水調(diào)和組（3.22±0.22）μg·cm-2與超微粉組相比，吳茱萸堿的Q24減少有統(tǒng)計學(xué)顯著意義（P＜0.001）；而加入了促透皮吸收劑氮酮的3 組實驗結(jié)果與超微粉組相比較，只有3%氮酮組（6.35±0.52）μg·cm-2的吳茱萸堿Q24增加有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各組的吳茱萸堿體外透皮吸收曲線、Q-t 擬合曲線和穩(wěn)態(tài)透皮速率Js分別見圖3 和表1。

表1 口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的體外透皮吸收Q-t 擬合曲線和穩(wěn)態(tài)透皮速率Js

圖2 口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的24 h 體外累積透皮量（，n=3）

圖3 口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的體外透皮吸收曲線

皮膚滯留量的檢測結(jié)果見圖4。吳茱萸堿的Qs在普通粉組（0.55±0.06）μg·cm-2與超微粉組（0.60±0.12）μg·cm-2相比較，無明顯差異；水調(diào)和組（0.25±0.08）μg·cm-2與超微粉組相比，吳茱萸堿的Qs出現(xiàn)顯著性減少（P＜0.05）；而加入了促透皮吸收劑氮酮的3 組實驗結(jié)果與超微粉組相比較，只有5%氮酮組（0.31±0.07）μg·cm-2的吳茱萸堿Qs有明顯減少（P＜0.05），1%組（0.54±0.15）μg·cm-2和3%組（0.69±0.02）μg·cm-2均無顯著性差異。

圖4 疳散穴位貼敷中吳茱萸堿的皮膚滯留量（，n=3）

4 討論

穴位貼敷療法既可以刺激穴位，又可以通過有效成分的透皮吸收而發(fā)揮顯著的藥理作用，因此具有較好的治療效果[7]。將口疳散穴位貼敷粘貼到足底涌泉穴，通過上病下治的機(jī)理，以達(dá)到治療口瘡病的目的。上病下治法是以中醫(yī)的整體觀念為前提，將疾病的病因病機(jī)、臟腑經(jīng)絡(luò)辨證以及氣機(jī)升降調(diào)節(jié)相結(jié)合而確立的治療原則，辨證論治、治病求本[8]。

通過透皮吸收實驗，測定不同制備工藝的口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿透皮吸收量，從而對其制備工藝進(jìn)行研究。在預(yù)實驗中，未能在接收液中成功檢測到吳茱萸堿，分析原因可能是透皮后的吳茱萸堿不穩(wěn)定，對光敏感，易被破壞，故在正式試驗的全過程中采用避光處理，從而準(zhǔn)確測得接收液中吳茱萸堿的含量。由實驗結(jié)果可知，藥材飲片經(jīng)過超微粉碎后，粒徑約為25 μm 與粒徑為150～200 μm 普通粉碎的藥材相比，其制得的口疳散穴位貼敷中吳茱萸堿Q24顯著性增加。分別使用醋和水調(diào)和超微粉、其配制的穴位貼敷中吳茱萸堿Q24也出現(xiàn)顯著性差異，醋調(diào)和組的吳茱萸堿Q24要明顯高于水調(diào)和組，表明醋對于口疳散穴位貼敷的療效發(fā)揮了重要作用。另外，兩者皮膚滯留量的實驗結(jié)果表明，醋調(diào)和組的吳茱萸堿皮膚滯留量也明顯高于水調(diào)和組。可能是因為醋與藥材中的吳茱萸堿等有效成分結(jié)合形成鹽，不僅使溶解度增加，使其從藥材中游離出來，且組成帶正電荷水溶液，更易于透過皮膚[9]。本研究還對促透皮吸收劑用量進(jìn)行實驗（1%、3%、5%氮酮），探討其對體外透皮吸收的影響，從實驗結(jié)果看出，只有3%氮酮的吳茱萸堿Q24出現(xiàn)顯著性增加，5%氮酮的吳茱萸堿Q24以及皮膚滯留量甚至比不加入促透皮吸收劑還低。可見加入適量促透皮吸收劑對貼敷的體外吸收有一定的促進(jìn)作用；但若用量過多，其透皮效果適得其反。考慮到醋酸能促進(jìn)口疳散穴位貼敷有效成分的透皮吸收作用，宜優(yōu)先選擇酸性的促透皮吸收劑，如油酸。在本研究中，探討了不同制備工藝對口疳散穴位貼敷中的吳茱萸堿透皮吸收的影響，為進(jìn)一步開發(fā)該制劑提供了實驗基礎(chǔ)。