高效液相色譜法測(cè)定枇杷潤(rùn)喉糖中11 個(gè)成分的含量

尚 姝，方 方，劉 園

江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019

枇杷潤(rùn)喉糖是常見的清咽類保健食品之一，在清咽潤(rùn)喉方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。枇杷葉為2014 年新批準(zhǔn)的食品原料，具有清肺止咳、降逆止嘔作用。枇杷葉的化學(xué)成分有三萜酸、黃酮類、多酚、倍半萜及糖苷類等[1-3]，其中黃酮類成分具有良好的抗氧化、降血脂、抑菌殺菌、增強(qiáng)免疫等作用[4，5]；三萜酸類成分具有抗炎止咳、降血糖、抗病毒和抗氧化的作用[6，7]。枇杷葉中三萜類成分主要有齊墩果酸、熊果酸、薔薇酸、委陵菜酸、馬斯里酸、科羅索酸等；黃酮類成分有山柰酚、槲皮素、高良姜素、橙皮苷、金絲桃苷、槲皮苷、異槲皮苷、蘆丁等[8-10]。目前在含有枇杷的清咽潤(rùn)喉類保健食品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，多采用紫外分光光度法，以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定樣品中總黃酮的含量，該方法專屬性不強(qiáng)。本試驗(yàn)選擇枇杷葉中3 個(gè)主要三萜成分、8 個(gè)主要黃酮類成分等11 個(gè)成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，為清咽類保健食品枇杷潤(rùn)喉糖的質(zhì)量控制提供參考方法。

1 儀器與藥品、試劑

高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；超聲清洗儀（德國(guó)Wiggens公司）。

對(duì)照品：蘆丁（批號(hào)：100080-202012）、金絲桃苷（批號(hào)：111521-201809）、異槲皮苷（批號(hào)：111809-201804）、槲皮苷（批號(hào)：111538-202007）、橙皮苷（批號(hào)：110721-202019）、槲皮素（批號(hào)：100081-201610）、山奈酚（批號(hào)：110861-201310）、高良姜素（3，5，7-三羥基黃酮，批號(hào)：111699-201703）、科羅索酸（批號(hào)：S27D9H78340）、齊墩果酸（批號(hào)：110709-201808）、熊果酸（批號(hào)：110742-201823），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為超純水。

樣品分別為A、B、C、D、E 廠家，來(lái)自2021 年國(guó)家保健食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)部門的檢品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

取除橙皮苷外其他10 個(gè)對(duì)照品5 mg，精密稱定，置5 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，得10個(gè)對(duì)照品的單標(biāo)儲(chǔ)備液。

取橙皮苷對(duì)照品10 mg，精密稱定，置15 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，得橙皮苷單標(biāo)儲(chǔ)備液。

精取以上11 個(gè)對(duì)照品單標(biāo)儲(chǔ)備液適量，置10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，得一定濃度的混標(biāo)儲(chǔ)備液S5。

精取混標(biāo)儲(chǔ)備液S5 0.5、1.0、2.0、4.0mL，置10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，得系列對(duì)照品溶液S1～S4。

2.2 樣品溶液的配制

取供試品適量，研細(xì)，混勻，取約1 g（精確至0.001 g），精密稱定，置具塞試管中，加入甲醇25 mL，密塞，渦旋1 min，超聲提取30 min，冷卻至室溫，搖勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，備用。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性要求

色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.1%磷酸水，流動(dòng)相B：乙腈，按表1 梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫為35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；。

表1 流動(dòng)相梯度

取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖（見圖1）。各色譜峰的理論板數(shù)均大于7000。

2.4 流動(dòng)相優(yōu)化

考察了0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%磷酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%磷酸-乙腈等4 個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果選用0.1%磷酸-乙腈作為流動(dòng)相溶液，在表1 梯度洗脫下獲得良好的分離效果，所測(cè)11 個(gè)成分均得到有效分離，有關(guān)色譜圖見圖1。

圖1 11 個(gè)成分對(duì)照品色譜圖及樣品色譜圖

2.5 線性范圍、檢測(cè)限與定量限

取系列對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各成分的線性范圍見表2。將對(duì)照品溶液注入高效液相色譜儀，按“2.3”色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以信噪比約為3∶1 的量確定為檢測(cè)限；約為10∶1 的量確定為定量限，得到11 個(gè)成分的檢測(cè)限和定量限。見表2。

表2 線性、線性范圍、檢測(cè)限及定量限

2.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液S5 適量，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別記錄11 個(gè)成分的峰面積，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、橙皮苷、槲皮素、山奈酚、高良姜素、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸的RSD（n=6）分別為0.38%、0.31%、0.28%、0.20%、0.36%、0.32%、0.19%、0.20%、0.19%、0.13%、0.13%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液S5，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、橙皮苷、槲皮素、山奈酚、高良姜素、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸RSD（n=6）分別為1.88%、1.19%、1.26%、0.52%、1.48%、0.60%、0.44%、0.45%、0.42%、0.53%、0.41%，表明穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取A 廠家供試品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法，平行制備6 份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸等8 個(gè)成分的峰面積，RSD 分別為0.63%、2.62%、0.99%、1.76%、0.66%、0.94%、1.15%、0.60%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

取A 廠家供試品0.5 g，加入適量對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下操作，平行制備6 份，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各成分的測(cè)得量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表3 各組分加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取5 個(gè)廠家的樣品，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見表4。

表4 5 個(gè)廠家的樣品測(cè)定結(jié)果（mg/100 g）

測(cè)定結(jié)果顯示，廠家E 所有成分均未檢出；廠家D 僅檢出科羅索酸一個(gè)成分；其余A、B、C 3 廠家樣品檢出成分在4～8 個(gè)。在5 個(gè)廠家的樣品中，只有廠家C 檢出現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中作為指標(biāo)成分總黃酮的蘆丁。

3 小 結(jié)

本研究建立了枇杷潤(rùn)喉糖中11 個(gè)主要成分的含量測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證基本可行。利用所建立的方法對(duì)2021 年國(guó)家保健食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)部門收集到的5 個(gè)廠家樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果不同廠家之間產(chǎn)品質(zhì)量差異大，提示有可能存在投料所用提取物的加工工藝不同所致，或另有其他原因。枇杷潤(rùn)喉糖現(xiàn)有的檢測(cè)方法專屬性不強(qiáng)；本方法能夠快速檢測(cè)枇杷潤(rùn)喉糖中的多種組分，專屬性較強(qiáng)，為評(píng)價(jià)該類產(chǎn)品的質(zhì)量提供了參考方法。