以蘭索拉唑腸溶膠囊為例探索模型引導的仿制藥等效性替代方法*

張錦琳，李 巖，陳 濤，周 穎，3，宋蕓峰，3，賈歡歡，4，袁耀佐**，張 玫，曹 玲

1 江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，國家藥品監督管理局化學藥品雜質譜研究重點實驗室,南京 210019；2上海凡默谷信息技術有限公司，上海 200127；3南京中醫藥大學，南京 210023；4中國藥科大學，南京 211121

蘭索拉唑是日本武田公司研制的質子泵抑制藥，其抑制胃酸分泌作用及抗幽門螺旋桿菌作用較強，在治療消化性潰瘍疾病方面有著顯著療效。但因其對酸不穩定，口服時多制成腸溶制劑。天津武田和日本武田的蘭索拉唑腸溶膠囊均為國家藥品監督管理局公布的參比制劑，國內還有較多蘭索拉唑腸溶膠囊的仿制藥，但因腸溶膠囊輔料多、工藝復雜，仿制藥與參比制劑往往形似而神不似，按質量標準檢驗均合格，但臨床療效差異較大，即現有質量標準無法保證產品的療效，因此藥品監管和制藥企業迫切需要建立一種通過體外檢驗反映體內療效的質量控制方法。本研究將探索建立體內外相關性與生物等效性的替代方法。

本研究通過搭建蘭索拉唑的體內PK 模型，反推口服給藥后在胃腸道內的釋放與吸收曲線，進而構建蘭索拉唑腸溶膠囊的體內外相關性模型，模擬出生物體相關的溶出方法。聯合仿制藥的體外溶出曲線研究結果，進而實現在不進行臨床BE 研究的情況下，僅通過比較該方法匯總的仿制藥與參比制劑體外溶出曲線，即可虛擬評估仿制藥與參比制劑的等效性情況。

1 軟件和材料

1.1 軟件

PBPK 建模軟件GastroPlus（version 9.0.0003，Simulations Plus，Inc.，USA）；Digit（version 1.0.4，Simulations Plus，Inc.，USA）；體外崩解與溶出模擬軟件DDDPlus（version 5.0.0011，Simulations Plus，Inc.，USA）。

1.2 藥品

蘭索拉唑腸溶膠囊（規格：30 mg），分別來自天津武田藥品有限公司和7 家仿制藥生產企業（企業A～G）。

2 方法與結果

2.1 驗證性PK 模型的搭建

收集蘭索拉唑建模所需的各種理化與生物藥劑學性質參數，如溶解度、滲透性、脂溶性、血漿蛋白結合率等[1-4]，主要模型參數見表1。

表1 蘭索拉唑PK 模型建立過程中的主要模型參數

主要來自文獻、軟件內建模以及基于化合物結構式預測的結果。查閱、提取文獻報道的蘭索拉唑經靜脈或口服給藥后在人體的血藥濃度-時間數據點；整理歸納所收集的數據，并綜合文獻報道的信息，全面梳理模型藥物的體內吸收、分布、代謝、排泄特點，以輔助更加準確地搭建藥物PK 模型，驗證PK 模型搭建的相關參數見表2。

表2 蘭索拉唑腸溶膠囊驗證PK 模型相關參數

以文獻報道的口服給藥[6]后的PK 數據作為參照，通過GastroPlus 軟件搭建蘭索拉唑的吸收和處置模型，并設置與文獻報道中相同的給藥途徑、給藥劑量、受試者人群等相關信息，然后進行血漿PK曲線的預測，強代謝人群和弱代謝人群口服參比制劑后PK 模擬結果分別見圖1 和圖2，并比對預測與實測曲線間的吻合程度（擬合度R2）、主要PK 參數（Cmax，Tmax，AUC）的預測值與觀測值的偏差（相關結果見表3），以確認所建立的模型是否可以重現已有的臨床結果，從而構建蘭索拉唑可靠、穩健的GastroPlus PK 模型[7，8]。以全面考察及驗證Gastro-Plus 模型對蘭索拉唑人體內的吸收、代謝和分布過程的擬合準確性，確定建模過程中的所有ADME 性質參數，以及相應的模型計算公式等。

表3 EMs 與PMs 人群口服參比制劑后，觀測數據與預測偏差信息

圖1 EMs 口服參比制劑后PK 模擬結果

圖2 PMs 口服參比制劑后PK 模擬結果

2.2 蘭索拉唑法定溶出條件體內外相關性評價

在“2.1”驗證后的蘭索拉唑體內PK 模型基礎上，借助機制性口服吸收模型（GastroPlus 的ACAT模型）反推得到蘭索拉唑（30 mg 腸溶膠囊）在胃腸道中的釋放與吸收曲線，見圖3；30 mg 蘭索拉唑腸溶膠囊腸道的局部吸收特征見圖4。

圖3 30mg 蘭索拉唑腸溶膠囊在胃腸道中的釋放與吸收曲線

圖4 30 mg 蘭索拉唑腸溶膠囊胃腸道的局部吸收特征

口服給藥后蘭索拉唑在胃腸道中基本可以完全跨膜吸收，主要的吸收部位是十二指腸和空腸。圖3 中可以看出，由于蘭索拉唑在吸收部位（pH 5～7）的溶解度較差，使得口服腸溶膠囊后在體內呈現緩慢釋放的行為，約2 個小時達到完全釋放；淺藍色的吸收曲線稍滯后于體內釋放曲線，溶出為分子狀態的藥物可以快速吸收進入腸細胞，并在溶出完全時完成吸收過程。預估體外溶出與體內釋放之間可以建立一定的相關性，限制腸溶膠囊制劑吸收快慢的主要因素為藥物的釋放速率。

本研究分別采用pH 6.8 和pH 6.0 兩種溶出介質考察參比制劑的體內外相關性：將各介質的溶出數據點加載至模型，然后通過Weibull 方程，將體外各時間點的累積溶出度擬合為體內連續溶出曲線，通過比對基于不同溶出介質曲線預測得到的PK曲線，與文獻中或臨床實測PK 曲線之間的擬合程度，分析制劑體外溶出曲線與體內PK 曲線之間的相關特征[9，10]，Weibull 方程如下：

其中，Max 為總溶出量（%）；T 為溶出滯后時間（h）；f1為1 相的溶出分數，f2為2 相的溶出分數，f3為3 相的溶出分數；b1、b2和b3分別為1 相、2 相和3相的形狀因子；A1、A2和A3分別為對應相的時間放大因子。

采用Weibull 方程處理蘭索拉唑參比制劑于pH 6.8 介質下的溶出曲線，示意圖見圖5。代入上述兩個介質測定的溶出曲線至腸溶膠囊參比制劑30 mg 的模型中，并利用體外溶出數據預測對應的體內PK 曲線，發現預測結果與該制劑臨床報道的血藥濃度-數據點均有一定的差異：這兩個介質預測的PK 曲線均低于觀測結果，曲線的吻合度R2僅在0.6 左右（其中pH 6.8 的吻合度稍好于pH 6.0 的結果），Cmax分別約低10%和25%，AUC 的預測與觀測結果較為一致，Tmax出現較大的差異（均快于觀測值25%以上，這是導致預測曲線擬合度較差的主要原因），說明直接采用這兩個介質的溶出曲線不能很好地預測體內PK 變化（見圖6、圖7）。

圖5 pH 6.8 介質下溶出曲線的Weibull 方程（圖中數據點為體外實測的溶出數值；線為根據實測數據擬合的Weibull釋放曲線；左側列舉了對應的Weibull 方程參數）

圖6 代入體外溶出曲線（pH 6.0）預測的PK 曲線

圖7 代入體外溶出曲線（pH 6.8）預測的PK 曲線

當前研究還進一步使用GastroPlus 軟件的體內外相關性（In Vivo In Vitro Correlations，IVIVC）模塊，將體外與體內累積釋放百分數進行相關性分析，結果見圖8、圖9。實線為相同時間點體外與體內釋放點所作的圖，虛線為基于相關性方程擬合的曲線。圖8 結果表明，pH 6.0 的曲線建立的相關系數R2較低，不能很好地進行體內外轉化，特別是累積釋放較高時呈現出較大的誤差。pH 6.8 溶出介質中建立的曲線相關系數較高，且總體曲線的重合度較好，可以較好地反映藥物在體內的釋放行為。因此，綜合Weibull 方程的PK 曲線預測結果以及IVIVC 的研究分析，可以發現體外pH 6.8 條件下的溶出行為與體內釋放具有一定的相關性，趨勢一致，但不是生物體相關的溶出方法，即每個時間點的體外釋放量完全對應體內釋放的量。

圖8 pH 6.0 體外溶出與體內累積釋放量之間的相關性

圖9 參比制劑在pH 6.8 溶出介質體外溶出與體內累積釋放量之間的相關性

由于當前的體外溶出曲線與體內的釋放過程有一定的差異，無法真實反映該藥物在體內的釋放的每一個時間點特性。借助體外崩解與溶出模擬軟件DDDPlus 考察體外溶出行為，通過該溶出模型，可結合腸溶膠囊的處方、溶出方法與條件等參數，進行相應溶出曲線的模擬；同時以參比制劑體內釋放曲線為目標，逐步優化體外溶出條件，使得模型預測的溶出曲線與目標體內釋放曲線一致，如圖10 所示，以輔助開發出生物體相關的溶出方法。通過調整溶出條件使得預測的溶出曲線和體內釋放點吻合一致，以建立反映體內釋放過程的生物體相關性溶出方法。模型最終推測的生物體相關性溶出方法為：采用USP I 法的籃法；設定儀器轉速為100 r·min-1；并在45 min 之前采用pH 5.5 的磷酸鹽緩沖液、45 min之后調整溶出介質的pH，形成pH 為7.4 的緩沖液作為溶出實驗的介質；介質體積為900 mL。

圖10 生物體相關溶出方法的優化結果

2.3 蘭索拉唑腸溶膠囊仿制制劑與參比制劑虛擬生物等效性評估

基于pH 6.8 介質下測定的溶出曲線和體內有一定的相關性，采用該溶出條件測定各制劑的體外溶出曲線，基于相關性的轉換方程以得到對應的體內釋放數據點，然后借助GastroPlus 軟件的Weibull方程轉化為體內連續釋放曲線。

由圖11 體外數據結果顯示，A、B、C、D 4 家企業的仿制藥呈現快速及完全地釋放行為，在當前溶出條件下基本在30 min 內即可溶出完全，尤其C、D 2 家的釋放速率較參比制劑更為迅速。E、F、G 3 家仿制藥則呈現較為緩慢且不完全的釋放行為，其中企業E 的初始釋放速率與參比制劑最為相似，但是超過2 h 時，該制劑表現為一定程度的降解，導致末端的釋放與參比制劑有一定的差異；企業F 及企業G 的制劑雖然初始釋放行為稍快于參比制劑，但最終的釋放程度較為接近參比制劑。

圖11 pH 6.8 介質下各仿制制劑體外溶出曲線

將各制劑的體外溶出數據用軟件轉化為圖12體內釋放曲線，轉化之后的曲線縮小了各仿制藥與參比制劑間的溶出差異。除企業E 外，其它6 家制劑均可在一定時間內達到體內完全釋放，而參比制劑完全釋放則需要3～4 h，這可能使這些廠家的制劑預測的體內達峰時間Tmax要小于參比制劑的結果，同時也可能由于快速釋放引起Cmax的不等效；而企業E 的釋放速度雖然最為接近參比制劑的特征，但是末端的不完全釋放，則可能使Cmax降低，造成Cmax和AUC 的不等效。

圖12 各仿制制劑經相關性轉化的體內釋放曲線

借助GastroPlus 的群體PK 模擬以及虛擬BE評估功能，GastroPlus 的群體模擬功能一次可虛擬產生2500 個受試者，并通過蒙特卡洛抽樣法[11]產生虛擬人群數據，包括胃腸道生理參數、PK 參數、制劑參數、給藥方案和化合物理化性質參數等，對上市仿制藥與參比制劑執行交叉虛擬等效性試驗。進行參比與受試制劑的群體PK 模型的設置，并虛擬48 個受試者進行PK 曲線的預測以及生物等效性的統計分析。模型分別評估了7 個仿制藥與參比制劑的等效性情況，發現來自企業A、B、F 及G 的仿制藥可能與參比制劑生物等效；而來自企業C、D 及E 的仿制藥則與參比制劑的主要PK 參數（Cmax,AUC）的統計學結果落在等效性范圍外，提示可能與參比制劑生物不等效。

現僅對企業A 和企業C 作出分析：企業A 與參比制劑的虛擬生物等效性評估結果見圖13；企業C 與參比制劑的虛擬生物等效性評估結果見圖14。

圖13 企業A 與參比制劑虛擬生物等效性評估結果（綠色為參比制劑，紅色為仿制制劑）

圖14 企業C 與參比制劑虛擬生物等效性評估結果（綠色為參比制劑，紅色為仿制制劑）

企業A 的仿制藥Cmax與AUC 均較接近參比制劑的結果，對數轉換后的Cmax的90%置信區間為107.60%～122.52%、對數轉換后的AUC0-inf的90%置信區間為82.52%～99.18%，提示可能與參比制劑生物等效。但該制劑的體外溶出數據（pH 6.8）顯示，初始的釋放行為要明顯快于參比制劑，可能會導致Tmax的差異，并進而引起Cmax的不等效，需要結合參比制劑的腸溶包衣特點，進一步優化腸溶包衣工藝；或優化當前的體外溶出方法。

企業C 仿制藥的Cmax高于參比制劑的結果，但兩者的AUC 較為接近。經對數轉換后的Cmax的90%置信區間為114.93%～134.22%、對數轉換后的AUC0-inf的90%置信區間為92.31%～110.57%，提示可能與天津武田的參比制劑生物不等效。其可能的原因是企業C 的仿制藥在體外表現出較快的釋放行為，進而加快了血漿中藥物濃度的達峰，造成Cmax超出了等效性的上限。

各仿制藥的體內釋放要快于參比制劑，導致仿制藥的Tmax較短、PK 曲線的行為有一定差異，此外較快的釋放速度，也容易引起峰濃度Cmax的不等效，因此聯合生物體相關的溶出方法，深入考察各仿制藥與參比制劑的釋放差異，并確定等效的可能性是較為合適的方式。

3 討論

隨著仿制藥質量與療效一致性評價的進程，僅僅用體外溶出曲線評價仿制藥與參比制劑的質量差異，而沒有進一步關聯制劑體內過程，忽略體內外相關性模型的搭建，具有一定的局限性。從國外研究情況來看，美國、日本、歐盟、加拿大等多國的藥監部門早已引入軟件，以輔助進行藥物體內行為的模擬、制劑體內外相關性的建立、生物等效性的研究等，提高了藥品審評審批的進度與合理性。通過軟件的預測，可模擬藥物在體內的行為，從而結合評價藥品在體內特征，來制定體外溶出度標準，建立體外溶出曲線與體內藥代曲線的相關性。可大大減少體外試驗的數量與成本，同時能獲得更合理及有區分力的體外溶出方法，真實反映仿制藥的內在質量。PBPK 模型在仿制藥的研發中潛力很大，但在應用中也需進行體內外數據的驗證，充分理解該制劑的吸收機理[12]，考慮臨床研究數據的平行性與可比性。目前，在應用上PBPK 模型還存在一些挑戰，如個體血藥濃度-時間數據點較難獲得、部分品種靜脈給藥的PK 數據查詢不到、體內外相關性溶出方法較難建立等[12]。

在模擬出可能生物體相關的溶出條件后，后續研究將在此條件下，以溶出曲線數據和收集到該品種的BE 數據，進行比對驗證，進一步來證實該替代方法的可行性和可靠性，為藥物的質量控制及一致性評價提供一種簡單、便捷的手段、為科學監管提供新的思路。