E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鱗狀細胞癌中的表達及其與淋巴結轉移的相關性研究

王 婧 李海婷

目前我國頭頸部惡性腫瘤的發病率約15/10萬，而頭頸部惡性腫瘤中的舌鱗狀細胞癌更是排在惡性腫瘤的第6位[1]。由于舌鱗狀細胞癌的發病部位特殊，舌內血管較為豐富，且運動頻繁，導致容易出現早期淋巴結轉移，并且治療后也容易復發[2]。粘附分子E(epithelial-cadherin，E-cadherin)是一種粘附分子，在胚胎的形成、組織結構的維持中發揮著重要意義，并參與到腫瘤的增生、分化和轉移當中[3]。平足蛋白(podoplanin，PDPN)能夠促進淋巴管祖母細胞自胚胎靜脈發育生成淋巴內皮細胞，是腫瘤淋巴結轉移的必要條件[4]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4 TLR4)是Toll樣受體的一種，在調劑免疫反應中發揮著重要的作用，近年來已被證實參與腫瘤的分化和轉移當中[5]。本研究選取我院收治82例舌鱗狀細胞癌患者臨產資料，以研究E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鱗狀細胞癌中的表達及與淋巴結轉移的相關性研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2020年1月我院收治82例舌鱗狀細胞癌患者作為研究對象。納入標準：①患者符合《口腔頜面腫瘤病理學》[6]中舌鱗狀細胞癌診斷標準；②患者通過病理學證實為舌鱗狀細胞癌；③患者無第二原發腫瘤；④患者術前未接受抗腫瘤治療。排除標準：①患者存在嚴重肝腎功能不全；②患者合并其他部位惡性腫瘤；③患者存在嚴重凝血功能障礙；④患者為妊娠期女性。82例舌鱗狀細胞癌患者，男性40例， 女性42例，年齡30～84歲，平均年齡(55.65±20.51)歲，根據TMN分期標準：Ⅰ期31例，Ⅱ期25例，Ⅲ期26例，分化程度：低分化34例，中分化36例，高分化12例，淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移44例。

1.2 方法

E-cadherin表達水平檢測方法：手術中切取患者癌組織和周圍健康組織，標本連續切片2張，分別采用HE和免疫組化染色法，嚴格按照SPTM法進行檢測，其中對于抗原的修復采用高溫高壓抗原組織修復法，送往鏡檢，在光鏡下進行觀察，胞膜內可觀察出棕黃色顆粒則可判斷為陽性，參考Shimzu標準，使用半計量法，分別對染色的細胞進行分部和染色分數計算：染色細胞標準：無著色細胞為0分，著色細胞低于組織細胞的三分之一為1分，著色細胞高于組織細胞的三分之一但不高于二分之三為2分，著色細胞高于二分之三為3分；染色細胞深度標準：不著色為0分，色淺為1分，色深為2分。將染色細胞和染色細胞深度分數相加，0分為-，2分為+，3分為++，4分為+++，5分為++++。

PDPN表達水平檢測方法：手術中切取患者癌組織和周圍健康組織，制成石蠟標本。采用二甲苯脫蠟，乙醇脫水，隨后以3%過氧化氫溶液去除標本內源性過氧化物酶，以pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液進行微波抗原修復，分別在兩個組織內滴加1∶2000稀釋的CellSignaling Technology公司的濃縮型兔抗人PDPN單克隆抗體，以4 ℃孵育，并隨后進行顯色、復染、脫色等操作送往鏡檢，在光鏡下進行觀察，染色細胞深度標準：無著色為0分，輕度著色或者淺黃色為1分，中度著色或者深黃色為2分，重度著色或者棕色為3分；在光鏡下隨機視野內500個細胞，1分為≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～80%，4分為>80%。將染色細胞和染色細胞深度分數相加，0分為-，2分為+，3分為++，4分為+++，5分為++++。

TLR4表達水平檢測方法：手術中切取患者癌組織和周圍健康組織，制成石蠟標本放于60 ℃烤箱內，隨后進行復水、清洗，采用檸檬酸鈉微波抗原修復，滴入Santa Cruz公司的兔抗人TLR4多克隆抗體，以4 ℃孵育，并隨后進行顯色、復染、脫色等操作送往鏡檢，在光鏡下進行觀察，400倍光鏡下進行技計數，光鏡下可發現細胞質以及細胞膜表現為棕黃色則可判定為陽性，切片隨機收集10個高倍視野內的細胞，每個切片內所含的陽性細胞數量為陽性細胞率，≥10%則判定為+，≥75%則為++，≤10%則為-。

1.3 觀察指標

檢測患者舌鱗狀細胞癌組織以及癌旁正常組織內E-cadherin、PDPN、TLR4的表達，同時與患者臨床特征進行分析。

1.4 方法

2 結果

2.1 舌鱗狀細胞癌組織以及癌旁正常組織內E-cadherin表達對比

舌鱗狀細胞癌組織中E-cadherin陽性表達率[41.46%(34/82)]顯著低于癌旁組織[85.36%(70/82)]，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 舌鱗狀細胞癌組織以及癌旁組織中E-cadherin表達對比(例，%)

2.2 舌鱗狀細胞癌組織以及癌旁組織內PDPN表達水平對比

PDPN在舌鱗狀細胞癌組織中陽性表達率[86.58%(71/82)]顯著高于癌旁組織[24.39%(20/82)]，差異具有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 舌鱗狀細胞癌組織以及癌旁組織內PDPN表達對比(例，%)

2.3 舌鱗狀細胞癌組織以及癌旁組織內TLR4表達對比

TLR4在舌鱗狀細胞癌組織中陽性表達率[87.80%(72/82)]顯著高于癌旁組織[13.41%(11/82)]，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 舌鱗狀細胞癌組織以及癌旁組織內TLR4表達對比(例，%)

2.4 E-cadherin表達與患者臨床特征分析

E-cadherin表達與患者性別、年齡無相關性(P>0.05)；TMNⅢ～Ⅳ期E-cadherin表達明顯低于TNMⅠ～Ⅱ期，淋巴結轉移患者E-cadherin表達水平明顯低于無淋巴結轉移的患者，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 E-cadherin表達與患者臨床特征的關系/例

2.5 PDPN表達與患者臨床特征的關系

PDPN表達與患者性別、年齡無相關性(P>0.05)；TMNⅢ～Ⅳ期PDPN表達明顯高于TNMⅠ～Ⅱ期，有淋巴結轉移患者PDPN表達水平明顯高于無淋巴結轉移患者，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 PDPN表達與其臨床特征的關系/例

2.6 TLR4表達與其臨床特征的關系

TLR4表達與患者性別、年齡無相關性(P>0.05)；TMNⅢ～Ⅳ期TLR4表達明顯高于TNMⅠ～Ⅱ期，有淋巴結轉移患者TLR4表達水平明顯高于無淋巴結轉移患者，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 TLR4表達與其臨床特征的關系/例

3 討論

由于舌部的血管豐富，并且經常運動，導致舌鱗狀細胞癌的轉移率明顯更高，患者的生存率約在60%，患者死亡的主要原因是淋巴結轉移或者復發[7-8]。隨著生物分子學的不斷進步，多項研究認為腫瘤的發生、發展以及淋巴結轉移與生物學分子密切相關[9-10]。目前臨床上對于E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鱗狀細胞癌表達的研究仍較少，本次研究在此基礎上對于其與患者臨床特征相關性進行分析，以為臨床診斷與治療提供指導。

E-cadherin是一種具有較高鈣依賴性的粘附因子，可以在人體的上皮組織內檢測到，分別由胞外區、跨膜區以及胞內區構成[11]。E-cadherin能夠作為受體也能夠充當配體。負責細胞間黏附反應的介導，當E-cadherin發揮作用時，其余粘附系統會失去作用.有研究發現，E-cadherin結構功能出現異常時，上皮結構的生成會出現障礙，將E-cadherin的基因轉染腫瘤細胞，能夠對腫瘤的侵襲和轉錄行為進行抑制，說明，E-cadherin是一種腫瘤抑制基因[12]。本研究表示：E-cadherin在患者舌鱗狀細胞癌組織的表達顯著低于癌旁組織(P<0.05)。Sgaramella等[13]發現：舌鱗狀細胞癌患者隨著癌組織內E-cadherin表達的升高，淋巴結轉移的存在一定的降低趨勢。這與本研究結果TMNⅢ～Ⅳ期E-cadherin表達明顯低于TNMⅠ～Ⅱ期，存在淋巴結轉移患者E-cadherin表達明顯低于不存在淋巴結轉移的患者(P<0.05)一致。分析因為E-cadherin對癌細胞的同嗜性粘附急性介導，組織癌細胞的脫落，從而限制癌細胞的轉移[14]。PDPN在人體的淋巴管內皮細胞中具有較高的表達，同時在侵襲性腫瘤內同樣具有一定的表達[15]。本研究表示：PDPN在患者舌鱗狀細胞癌組織的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。有研究表示：PDPN在舌鱗狀細胞癌組織的表達明顯高于癌旁組織，且與淋巴結轉移存在相關性[16]，這與本研究結果TMNⅢ～Ⅳ期的患者癌組織內PDPN表達明顯高于TNMⅠ～Ⅱ期，存在淋巴結轉移患者癌組織內PDPN、表達明顯高于不存在淋巴結轉移的患者(P<0.05)一致。我們推測可能因為PDPN能夠造成E-cadherin的低表達，進而使細胞的接觸抑制，引起上皮間質轉化，進而促進癌細胞的轉移和增生[17]。TLR4屬于TLRs 的一種，在多種腫瘤細胞內均有一定的表達。TLR4雖然能夠加強人體對于腫瘤的免疫反應，但也能為腫瘤細胞的增殖發育提供環境，促進腫瘤的增殖分化[18-19]。本次研究發現：TLR4在患者舌鱗狀細胞癌組織的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)。有研究認為TLR4能夠促進腫瘤壞死因子-α的分泌，進而促進樹突細胞的成熟，加強T細胞以及巨噬細胞的合成，殺死腫瘤細胞。Anna等[20]研究得出，TLR4在患者舌鱗狀細胞癌組織的表達明顯升高，但與患者的淋巴結轉移無相關性。這與本研究結果不一致，分析可能由于病例收集較少所引起。本次研究E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鱗狀細胞癌中的表達的基礎上對其與淋巴結節轉移進行相關性研究，為舌鱗狀細胞癌的診斷與淋巴結轉移預測提供幫助，但是本次研究仍存在一定的局限性，主要因為病例收集較少，且均來自同一省份，可能造成一定的偏差，所以以后應當加大病例的采集。

綜上所述，舌鱗狀細胞癌患者體內E-cadherin存在明顯的降低，PDPN、TLR4明顯升高，并且研究發現存在淋巴結轉移以及分期較高的患者體E-cadherin顯著更低，PDPN、TLR4顯著更高。