縫隙連接蛋白43的表達與胃癌患者臨床病理特征及預后的相關性

顧慧杰 李卓群 孫啟棣 徐海榮 韓保衛 王云帥 寇 玉

胃癌起源于胃黏膜上皮，在我國各種惡性腫瘤中發病率居首位。胃癌發病有明顯的地域性差別，并受到不同基因的影響。因此，有必要研究能準確反映胃癌生物學特性的標志物，為胃癌提供新的分子診斷和預后標志，并為靶向治療胃癌提供新的方向。

近年來，連接蛋白的失調和通過縫隙連接的細胞間通訊被證明與癌癥的發病機制有關[1]。縫隙連接存在于人體的所有細胞中,是細胞通訊的重要組成部分，由6個連接蛋白形成的2個相對的半細胞膜組成，是2個細胞之間小分子、多肽、離子、內源性核酸和其他細胞代謝物傳遞和交換的重要通道。因此，異常的縫隙連接表達可以改變細胞代謝，促進癌癥的遷移和侵襲[2]。Cx43是研究最為豐富和廣泛的結合蛋白，根據其分子量43 kDa而命名。在各種類型的癌癥中CX43的表達常常下調，同時縫隙連接功能也被抑制，因此cx43常被認為是一種抑癌因子[1]。有研究發現CX43表達可作為喉鱗狀細胞癌預后的一種有用的檢測指標[3]。此外，Maria等經研究發現高表達Cx43的乳腺癌患者生存率高于低表達患者，低表達Cx43與患者的預后不良相關[4]。然而目前Cx43表達水平與胃癌患者預后相關性的報道較少，所以探討Cx43在胃癌組織中的表達與臨床病理特征和預后的相關性，可能為胃癌患者的臨床診斷和預后提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 病例及標本

收集2015年2月至2017年1月于鄭州大學附屬洛陽中心醫院胃腸外科行手術治療的68例胃癌患者的癌組織和癌旁正常組織(離腫瘤切緣>5 cm)?；颊咧心行?4名、女性14名，隨訪至2020年8月。術后對晚期胃癌患者進行常規化療，未對患者進行放療。本研究病例納入標準包括：①組織學證實的腺癌；②無胃切除術史或其他惡性腫瘤病史；③無其他病理類型的胃腫瘤，如胃間質瘤；④有完整的臨床病理和生存資料；⑤患者未接受新輔助化療；⑥無遠處轉移。本研究經洛陽市中心醫院人文學科機構委員會批準。所有研究參與者或其法定監護人在研究入組前都簽署了知情同意書。

臨床病理資料：前瞻性地記錄臨床病理資料，以便進行回顧性分析。 68例胃癌患者的臨床病理資料包括年齡、性別、原發腫瘤的大小、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、分化程度。對照組由68個石蠟包埋組織塊的癌旁胃正常組織(>5厘米腫瘤切緣)組成。

1.2 免疫組織化學

用獲得的標本進行了Cx43的免疫組化染色，標本由10%福爾馬林固定的石蠟包埋組織的連續4 μm厚切片組成。脫蠟并復水后將石蠟切片組織置于3%過氧化氫(H2O2)中10 min以滅活內源性過氧化物酶，接著在微波爐高火煮沸3 min以降低非特異性結合的活性。 然后用5%BSA孵育30 min以封閉非特異性結合，用兔源Cx43抗體(#3512S；CST生物技術公司，美國，最終稀釋1∶500)在4 ℃孵育過夜。緩沖液沖洗3次，二抗是生物素化羊抗兔IgG(SA1022,博士德生物技術有限公司，美國),接著用鏈霉親和素-生物素結合酶室溫孵育30 min，緩沖液沖洗后用DAB(AR1022，博士德生物技術有限公司，美國)顯色并用蘇木精復染，最后脫水并用中性樹脂封片。

1.3 免疫組化分析與評價

在光鏡下細胞質被染色為深棕色的腫瘤細胞被認為是Cx43IHC染色陽性。通過染色強度和染色細胞百分比定量Cx43的表達。未染色細胞評分為0分，1分為弱染色強度，2分為中等染色強度，3分代表較強的染色強度。通過ImageJ軟件評估了染色陽性細胞的百分比(0～100)。Cx43表達的最終分數等于兩種類型分數相乘(0～300)。根據患者生存狀態繪制ROC曲線發現Cx43表達水平在5.43時約登指數最大，見圖1。以5.43為截點將68例患者Cx43表達分為陽性組(n=35)及陰性組(n=33)。

圖1 ROC曲線

1.4 統計分析

采用SPSS19.0軟件進行統計分析。通過卡方檢驗分析Cx43表達與臨床病理特征的相關性。采用Kaplan-Meier分析構建患者的無病生存曲線和總生存曲線。運用Cox回歸分析評價胃癌患者預后的獨立影響因素。P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織中Cx43的表達情況

免疫組化結果顯示，癌旁胃正常組織Cx43染色較深，而胃癌組織的Cx43染色則較淺，見圖2。此外，根據免疫組化評分，68例胃癌患者組織中35例患者Cx43的表達為陽性，陽性率為51.47%；癌旁胃正常組織則有65例Cx43表達為陽性，陽性率為95.58%，兩者Cx43表達差異有統計學意義(χ2=-11.799，P<0.001)。

圖2 Cx43在胃癌組織及癌旁胃正常組織中的表達(DAB X200)

2.2 胃癌患者Cx43的表達與臨床病理特征的相關性

對68例腫瘤標本的免疫組化染色結果分析表明，Cx43表達水平與腫瘤最大直徑(P=0.004)、腫瘤浸潤深度存在顯著相關(P=0.012)，而與其他臨床病理特征之間沒有明顯的相關性，包括患者的年齡、性別、腫瘤的分化程度及淋巴結轉移或遠處轉移、TNM分期等，見表1。

表1 68例胃癌患者Cx43表達與臨床病理變量的相關性分析/例

2.3 Cx43表達與胃癌患者預后的關系

通過Kaplan- Meier分析評價Cx43表達和臨床病理特征對無病生存期及總生存期的影響。結果表明，Cx43低表達組5年生存率為3%，Cx43高表達組為25.7%，低表達Cx43提示更差的預后(P<0.001，見圖3)。

圖3 Cx43表達與患者預后的關系

2.4 胃癌患者預后相關影響因素分析

對68例患者無病生存期及總生存期的單因素分析發現，Cx43表達、腫瘤最大直徑、分化程度、腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移及遠處轉移與患者的無病生存期及總生存期相關(P均<0.05，見表2)。進一步Cox回歸分析表明，Cx43表達、腫瘤最大直徑、腫瘤分化程度及浸潤深度與無病生存期及總生存期密切相關，見表3。這提示，Cx43的表達、腫瘤最大直徑、腫瘤分化程度及浸潤深度可作為胃癌患者的獨立預后指標。

表2 68例胃癌患者總生存期及無病生存期影響因素的單因素分析/月

表3 68例胃癌患者總生存期、無病生存期的影響因素的多因素分析

3 討論

已有研究表明，鼻咽癌、甲狀腺癌、喉鱗狀細胞癌、星形細胞瘤、黑色素瘤及慢性B細胞白血病患者的Cx43表達水平降低，低表達水平Cx43與患者的惡性程度及預后不良有關[3,5-7]。一項關于120例胃癌患者的研究發現，胃正常組織中Cx43的表達高于胃癌組織，同時Western印記實驗也證實了同樣的結果[8]。這與我們的實驗結果相同，但作者并未對Cx43表達與胃癌患者的預后相關性進行研究分析。因此，本文對Cx43表達與胃癌患者的臨床病理特征及預后相關性進行了研究。

大量的實驗數據表明縫隙連接蛋白的失調及通過縫隙連接的細胞間通訊與腫瘤的發生發展有關[9]。 我們的結果表明，胃癌患者Cx43表達陽性率低于癌旁胃正常組織(51.47%VS 95.58%，P<0.001)，這與前文所說的Cx43在其他腫瘤中的低表達特征相一致。羅吉琴等通過分析鼻咽癌組織中Cx43、Cx26的表達與患者臨床病理特征的相關性后發現Cx43表達與T分期、臨床分期及淋巴結轉移相關，而與性別、年齡、病理類型、病灶大小無關[6]。郭愛萍等經研究發現在非小細胞肺癌中Cx43的表達與病理類型、分化程度及Ki-67表達有關[10]。Shao等經研究發現通過逆轉錄小干擾RNA可以下調Cx43促進乳腺癌細胞的侵襲性表型[11]。這提示低表達Cx43可能與胃癌患者的發生發展相關。為了進一步證明我們的推測，我們分析了68例胃癌患者Cx43表達與臨床病理特征的相關性。結果表明，Cx43表達與腫瘤最大直徑、腫瘤浸潤深度存在顯著相關，而與其他臨床病理特征之間沒有明顯的相關性，包括患者的年齡、性別、腫瘤的分化程度及淋巴結轉移或遠處轉移、TNM分期等。Cx43低表達主要出現在腫瘤體積較大、浸潤較深的組織中，這些結果驗證了我們關于Cx43參與腫瘤發生發展過程的推測。

文獻報道，Cx43表達還與惡性腫瘤的預后相關。王俊嶺等經研究發現低表達Cx43是影響黑色素瘤患者預后的影響因素[7]。董郁紅指出,Skp2和 Cx43可作為甲狀腺乳頭狀癌惡性程度指標及預后指標[12]。為了探討Cx43與胃癌患者預后的相關性，我們通過Kaplan-Meier分析不同Cx43表達的胃癌患者發現，低表達Cx43患者的無病生存率及總生存率明顯低于高表達Cx43患者，提示Cx43表達情況可作為胃癌患者的預后指標。進一步C0X回歸分析表明Cx43表達、腫瘤最大直徑、腫瘤分化程度及浸潤深度均可作為胃癌患者的獨立預后指標。因此，臨床醫師可根據胃癌患者Cx43表達情況為患者制定不同的術后診療方案，低表達Cx43往往提示更差的預后，需要進一步的術后輔助治療并加強復查。

然而，有研究指出Cx43在原發性骨腫瘤中作為腫瘤抑制因子的同時也可作為腫瘤促進因子在腫瘤的發展中起著拮抗作用[13]，所以Cx43在胃癌發展過程中的具體作用機制還有待進一步的研究。總的來說，本研究表明在胃癌組織中Cx43的表達降低且這種低表達可能與腫瘤的侵襲轉移相關。近年來，針對關鍵分子驅動因素的靶向治療已經成為臨床治療癌癥的重要方式，Cx43可被用作潛在的生物標志物，為胃癌的臨床治療及預后分析提供新的方向。