結(jié)直腸癌周期蛋白E和生存素的表達(dá)及臨床意義

張勁遠(yuǎn)，何磊，劉遠(yuǎn)成，李永海，張承岳，徐烈娟，李瑞

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 合肥市第一人民醫(yī)院 a.普外科，b.中醫(yī)肛腸科，c.胃腸外科，合肥 230061)

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年結(jié)直腸癌新發(fā)病例超過50萬[1]。隨著我國人民生活水平的不斷提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，已成為近十幾年來發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，且尤以經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率較高[2]。隨著生物分子學(xué)研究的不斷發(fā)展，研究顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)生與多個(gè)癌基因的激活以及抑癌基因的失活密切相關(guān)[3]。結(jié)直腸上皮黏膜腺體以及間質(zhì)成分細(xì)胞的增殖調(diào)控異常在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]，如周期蛋白E，其作為細(xì)胞正向周期調(diào)節(jié)因子，可通過促進(jìn)中心體的過度增殖、干擾有絲分裂以及染色體的形成等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。生存素作為抑制凋亡基因家族成員之一，可抑制細(xì)胞凋亡而促使腫瘤生長[6]。研究表明，結(jié)直腸癌中生存素的表達(dá)與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期密切相關(guān)[7]。本研究主要從生物學(xué)角度，通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)周期蛋白E和生存素在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，探討兩者與結(jié)直腸癌生物學(xué)病理因素的相關(guān)性，以期為結(jié)直腸癌的早期診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年9月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除治療的60例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織。其中男32例、女28例，年齡36～90歲，平均(58±6)歲。患者在取樣前均未接受放療和化療，所有組織的選取位置距離癌變部位10 cm以上。依據(jù)《消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》[8]作為參考，組織分化：低分化12例、中分化17例、高分化31例；Dukes分期：Ⅰ期3例、Ⅱ期30例、Ⅲ期24例、Ⅳ期3例；未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例；腫瘤浸潤位置：黏膜層6例、肌層6例、漿膜層48例。選取同期進(jìn)行結(jié)直腸外科手術(shù)的30例非結(jié)直腸癌患者的正常結(jié)直腸組織作為對(duì)照，其中男17例、女13例，年齡38～75歲，平均(58±5)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法 使用10%的中性甲醛固定標(biāo)本，對(duì)其包埋切片，連續(xù)切片的厚度為3～4 μm，采用Envision兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。選用0.01 mol/L、pH值為6.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗切片，清洗3次，每次3 min；將選取的組織抗原放置微波爐內(nèi)進(jìn)行加熱修復(fù)。每張切片均加入1滴過氧化酶阻斷溶液，在室溫條件下進(jìn)行孵育，時(shí)間為10 min。PBS沖洗3次，去除PBS，在切片下滴入1滴正常的非免疫動(dòng)物血清，在室溫條件下孵育，時(shí)間為10 min。將血清去除，在切片上滴入鼠抗人周期蛋白E抗體，室溫條件下孵育60 min，再使用PBS清洗3次，每次3 min。在切片上滴入生存素單克隆抗體，室溫下孵育3 min，PBS沖洗。每張切片上加入2滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺顯色劑，將其放置顯微鏡下觀察3～10 min。使用自來水將其沖洗，蘇木精進(jìn)行復(fù)染，使用自來水或PBS沖洗，對(duì)于二氨基聯(lián)苯胺顯色的切片，每張切片需要使用梯度乙醇脫水干燥，使用中性樹膠進(jìn)行封固。

1.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 腫瘤細(xì)胞周期蛋白E和生存素在免疫組織化學(xué)陽性反應(yīng)中呈棕黃色顆粒，周期蛋白E定位于細(xì)胞核，生存素主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)在細(xì)胞核，陽性定義為著色細(xì)胞≥10%。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：采用雙盲試驗(yàn)法，分別由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行閱片。結(jié)果判斷參照Kawasaki等[9]制訂的半定量積分標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡下觀察，若組織細(xì)胞出現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒，則為陽性細(xì)胞。選取10個(gè)高倍視野組織，按照組織中陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：若陽性細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)<5%，記為0分；5%≤陽性細(xì)胞數(shù)<25%，記為1分；25%≤陽性細(xì)胞數(shù)<50%，記為2分；50%≤陽性細(xì)胞數(shù)<75%，記為3分；陽性細(xì)胞數(shù)≥75%，記為4分。按照著色程度計(jì)分：組織染色呈現(xiàn)淡黃色，記為1分；組織染色呈現(xiàn)黃色，記為2分；組織染色呈現(xiàn)棕黃色，記為3分。將兩個(gè)計(jì)分結(jié)果相乘，即可得出陽性強(qiáng)度：0分為陰性、1～4分為弱陽性、5～8分為中度陽性、9～12分為強(qiáng)陽性。

2 結(jié) 果

2.1正常結(jié)直腸組織與結(jié)直腸癌組織中周期蛋白E、生存素的表達(dá)情況 結(jié)直腸癌組織中，周期蛋白E陽性表達(dá)率為75.0%(45/60)，其中弱陽性18例、中度陽性15例、強(qiáng)陽性12例；生存素陽性表達(dá)率為50.0%(30/60)，其中弱陽性11例、中度陽性10例、強(qiáng)陽性9例；正常結(jié)腸組織中，周期蛋白E陽性表達(dá)率為3.3%(1/30)，生存素陽性表達(dá)0例。結(jié)直腸癌組織組中周期蛋白E和生存素的陽性表達(dá)率高于正常結(jié)直腸組織(χ2=30.077，P<0.001；χ2=16.000，P<0.001)，見圖1、圖2。

圖1 結(jié)直腸黏膜組織中周期蛋白E的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色法，×400) 1a為正常結(jié)直腸黏膜周期蛋白E陰性表達(dá)，1b為結(jié)直腸癌黏膜周期蛋白E弱陽性表達(dá)，1c為結(jié)直腸癌黏膜周期蛋白E中度陽性表達(dá)，1d為結(jié)直腸癌黏膜周期蛋白E強(qiáng)陽性表達(dá)

圖2 結(jié)直腸黏膜組織中生存素的表達(dá)情況 (免疫組織化學(xué)染色法，×400) 2a為正常結(jié)直腸黏膜生存素的陰性表達(dá)，2b為結(jié)直腸癌黏膜生存素弱陽性表達(dá)，2c為結(jié)直腸癌黏膜生存素中度陽性表達(dá)，2d為結(jié)直腸癌黏膜生存素強(qiáng)陽性表達(dá)

2.2結(jié)直腸癌組織中周期蛋白E和生存素蛋白的陽性表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 不同性別、組織分化、腫瘤浸潤位置周期蛋白E和生存素陽性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；年齡≥50歲者周期蛋白E和生存素陽性表達(dá)率均高于年齡<50歲者(P<0.05)；Dukes分期為 Ⅲ～Ⅳ 期者周期蛋白E和生存素陽性表達(dá)率均高于Ⅰ～Ⅱ期者(P<0.05)；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者周期蛋白E和生存素陽性表達(dá)率均高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，見表1。

表1 結(jié)直腸癌中周期蛋白E和生存素蛋白的陽性表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 [例(%)]

2.3結(jié)直腸癌中周期蛋白E和生存素表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理因素的相關(guān)性 周期蛋白E和生存素陽性表達(dá)強(qiáng)度與Dukes分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)(P<0.01)，見表2。

表2 結(jié)直腸癌中周期蛋白E和生存素的表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理因素的相關(guān)性

3 討 論

腫瘤的形成過程極為復(fù)雜，受多因素、多基因間的相互作用影響最終形成惡性腫瘤[10]。生物體在生長發(fā)育過程中，維持機(jī)體正常細(xì)胞的增殖、凋亡，細(xì)胞增殖、凋亡失調(diào)將對(duì)組織細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生不良影響，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[11]。據(jù)相關(guān)研究顯示，在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展過程中細(xì)胞增殖和凋亡均發(fā)揮重要作用[12]。

在細(xì)胞周期調(diào)控過程中，周期蛋白E發(fā)揮重要作用，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，該蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2結(jié)合，可以促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而使細(xì)胞周期正常運(yùn)轉(zhuǎn)。通常情況下，周期蛋白E的合成主要處于G1中期，當(dāng)細(xì)胞至S期后，與脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸存在關(guān)系的蛋白會(huì)發(fā)生水解，從而導(dǎo)致周期蛋白E水平急速下降，因此在細(xì)胞的G2和M期不存在周期蛋白E表達(dá)，在整個(gè)細(xì)胞周期期間，周期蛋白依賴性激酶2的表達(dá)水平保持穩(wěn)定[13]。腫瘤發(fā)生過程中，周期蛋白E在整個(gè)細(xì)胞周期間表達(dá)，從而激活細(xì)胞周期中的周期蛋白依賴性激酶2，導(dǎo)致一些已經(jīng)停止繁殖的細(xì)胞不斷增殖，進(jìn)入細(xì)胞周期內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[14]。許曉陽等[15]通過對(duì)比原發(fā)性結(jié)直腸癌、正常結(jié)直腸黏膜以及息肉中周期蛋白E的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，周期蛋白E的表達(dá)水平與腫瘤大小、病理分級(jí)以及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，可以將周期蛋白E作為結(jié)直腸癌的判斷指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，Dukes分期為Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者周期蛋白E的陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。可見，周期蛋白E的過表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用，可參與結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展。

生存素是一種細(xì)胞凋亡抑制蛋白，屬于目前研究中最強(qiáng)的一種凋亡抑制因子，其除對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用外，還可以保護(hù)血管、促進(jìn)腫瘤血管的生成以及在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中具有調(diào)節(jié)性作用等。研究表明，生存素在正常的分化組織中不表達(dá)，但是在各種腫瘤組織中呈高表達(dá)，該性質(zhì)使其在腫瘤的早期診斷、治療以及預(yù)后評(píng)價(jià)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)生存素表達(dá)水平升高可抑制細(xì)胞的正常凋亡，延長腫瘤細(xì)胞生存期，使已經(jīng)停止增殖的細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖和惡化，增加結(jié)直腸癌的發(fā)生率[16]。另有研究顯示，生存素具有多種生物學(xué)活性，可通過抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)血管、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[17]。楊東杰和姚宏[18]對(duì)66例大腸癌組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)生存素在大腸癌組織中的陽性表達(dá)率為71.21%(47/66)，Dukes分期為Ⅲ～Ⅳ期及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者生存素的陽性表達(dá)率均為81.58%(31/38)。本研究結(jié)果顯示，Dukes分期為Ⅲ～Ⅳ期以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者生存素陽性表達(dá)率明顯升高，與上述研究結(jié)果類似。提示生存素的高表達(dá)對(duì)細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生抑制作用，不僅提高結(jié)直腸癌癌細(xì)胞的生存能力，還參與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平可能成為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的潛在指標(biāo)。

研究表明，生存素的表達(dá)與患者的年齡、性別以及腫瘤的分化程度無相關(guān)性，但與患者的Dukes分期和淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示，周期蛋白E和生存素表達(dá)強(qiáng)度與Dukes分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)(P<0.01)，與上述研究結(jié)論類似。提示，周期蛋白E、生存素與結(jié)直腸癌患者臨床分期和是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系，周期蛋白E的表達(dá)可能將結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行部分轉(zhuǎn)化，即從G1期轉(zhuǎn)化至S期，使DNA合成增加。而生存素則使經(jīng)DNA合成后的細(xì)胞從G2期轉(zhuǎn)化為M期，周期蛋白E和生存素發(fā)揮協(xié)同作用，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，使患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床癥狀和體征表現(xiàn)更加明顯[21-23]。

綜上所述，周期蛋白E和生存素在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，與患者的Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可成為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。