miR-652對非小細胞肺癌H460細胞凋亡和遷移的影響

王建宇 馬文俊 王 瑩

在全球范圍內，肺癌在過去幾十年中一直是最常見的癌癥之一。2018年，肺癌新診斷有210萬例，占全球癌癥總量的12%[1]。肺癌是世界范圍內癌癥死亡的主要原因之一。在過去10年中，腫瘤的治療經歷了巨大的變化，靶向治療的發展，開創了個性化醫學和免疫治療的時代。這些治療方法的發展為腫瘤患者的長期生存奠定了一定的基礎，提高了對腫瘤轉移患者進行有效治療的可能性。過去10年中，除了遺傳研究之外，表觀基因組研究特別是對miRNA的研究在數量和質量上都迅速增長。

miRNAs是一種長度19～25 nt的小非編碼RNA，可以調控多種靶基因。miRNAs參與調節多種生物學過程，如細胞周期、分化、增殖、凋亡、耐受性、能量代謝和免疫應答等[2]。對于miRNA的非調控表達在包括癌癥在內的大多數人類疾病的發病機制中已經得到了很好的研究[3-4]。miRNA的異常表達通常是由于遺傳修飾導致的，它們既可能是腫瘤抑制因子，也可能是癌基因，這對人類惡性腫瘤的發生和發展至關重要[4]。研究證實了miRNAs潛在的致癌潛力，如調節細胞增殖、細胞周期、分化、發育、遷移、血管生成和凋亡[5-6]。miR-652最近被鑒定為腫瘤相關基因。本研究就miR-652對非小細胞肺癌H460細胞凋亡和遷移的影響進行分析。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與細胞培養 肺癌細胞株H460在RPMI 1640培養液中培養，人支氣管上皮細胞（HBE）在DMEM培養基中培養。于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。

1.1.2 主要儀器 ECLIPSE TE2000-S倒置顯微鏡、SpectraMax M3多功能酶標儀、GE AI600多功能成像儀。

1.2 方法

將H460肺癌細胞隨機分為對照組、miR-652組、miR-652+AMO-652組和亂序組。

1.2.1 細胞計數 在轉染miR-652的前1 d，將細胞接種到6孔板上（每孔5×104個細胞）。用X-tremeGENE siRNA轉染試劑將miR-652轉染。轉染后48 h，用臺盼藍染色，用細胞計數儀計數細胞數。1）用qRT-PCR技術分別檢測了H460細胞與HBE細胞中的miR-652表達水平。2）應用細胞記數儀分別計數對照組、亂序組、不同濃度miR-652處理過的H460細胞數量，miR-652的濃度分別為10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L。3）以0、24、48、72、96 h時間點分別計數對照組、亂序組、50 nmol/L miR-652處理過的H460細胞數量。

1.2.2 細胞遷移試驗 細胞劃痕實驗評估細胞遷移。在轉染24 h后，在融合細胞單層上用200 μl吸管尖端進行劃痕。為了觀察H460細胞傷口愈合情況，分別在處理后0、24、48和72 h拍攝圖像。

1.2.3 蛋白質免疫印跡法檢測蛋白表達 用X-treme-GENE siRNA轉染試劑分別將miR-652（50 nmol/L）、miR-652+AMO-652、亂序轉染H460細胞。H460細胞于轉染前1 d接種于6孔板（5×104個/孔）。轉染后，提取總蛋白進行蛋白質免疫印跡法分析。約70 μg天然蛋白在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠中變性和電泳。電泳后，用電泳印跡法將凝膠轉移到PVDF膜上，在含5%脫脂牛奶的PBS中室溫封閉2 h。免疫印跡分別與一抗（Bax或caspase-9）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）共同孵育，4 ℃孵育過夜。膜用磷酸鹽緩沖液（PBS-T）洗滌，然后用二抗Alexa Fluor在室溫下孵育1 h。最后，用GE AI600多功能成像儀收集蛋白質免疫印跡條帶，以GAPDH為內參，用Odyssey v1.2軟件測量各組的強度（面積×OD）。將數據進行歸一化處理。

1.3 統計學分析

采用Graphpad Prism 5.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較使用t檢驗，多組實驗結果比較使用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-652對H460細胞計數的影響

H460細胞中miR-652表達明顯低于HBE細胞中miR-652表達（P＜0.05）（圖1A）。對照組與亂序組、10 nmol/L miR-652組、25 nmol/L miR-652組的H460細胞數量比較差異無統計學意義（P＞0.05），而當miR-652的濃度分別為50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L時與對照組比較H460細胞數量差異有統計學意義（P＜0.05）；隨著miR-652的濃度增加，H460細胞數量逐漸減少（P＜0.05），在miR-652的濃度達到50 nmol/L及以上時，H460細胞數量減少明顯（P＜0.05）（圖1B）。miR-652組與對照組、亂序組的H460細胞數量不同時間點差異有統計學意義（P＜0.05），尤其是72 h后差異明顯（P＜0.05），miR-652轉染的H460細胞數量明顯減少（P＜0.05）（圖1C）。

圖1 miR-652對H460細胞數量的影響

2.2 miR-652對H460細胞遷移的影響

與對照組比較，轉染miR-652的H460細胞的遷移速度下降；AMO-652的共轉染則取消了miR-652對H460細胞的這種作用；而亂序組對H460細胞的遷移速度無影響。見圖2、表1。

表1 各組H460細胞遷移率比較(%,±s)

表1 各組H460細胞遷移率比較(%,±s)

注：H460細胞各分組遷移率統計；與對照組比較，aP＜0.05；與miR-652+AMO-652組比較，bP＜0.05

組別 細胞遷移對照組 1 miR-652組 0.47±0.03ab miR-652+AMO-652組 0.82±0.05亂序組 1.02±0.06

圖2 miR-652對H460細胞遷移的影響

2.3 miR-652對H460細胞中Bax和caspase-9蛋白表達的影響

與對照組比較，miR-652組凋亡蛋白Bax和caspase-9的表達明顯增加，而與miR-652組比較，AMO-652的共轉染miR-652+AMO-652組凋亡蛋白Bax和caspase-9的表達減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組H460細胞凋亡蛋白Bax和caspase-9表達比較(±s,n=5)

表2 各組H460細胞凋亡蛋白Bax和caspase-9表達比較(±s,n=5)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與miR-652組比較，bP＜0.05

組別 凋亡蛋白Bax 凋亡蛋白caspase-9對照組 1 1 miR-652組 18.88±1.24a 18.64±1.12a miR-652+AMO-652組 5.22±0.36b 5.43±0.32b亂序組 0.92±0.06 6.84±0.46

3 討論

miR-652已經在幾個組織中得以確認，并被證明發揮著重要的功能。越來越多的證據表明miR-652是一個參與多種生物學過程的多功能分子，例如miR-652通過抑制CD4+T細胞的分化來減輕肝纖維化[7]；參與了許多中樞神經系統疾病的發病，包括缺血性中風，是這些疾病的重要生物標志物[8]；miR-652-3p在骨肉瘤、直腸癌和乳腺癌中上調，但在惡性胸膜間皮瘤中下調[9]；miR-652可以作為區分惡性胸膜間皮瘤和反應性間皮細胞增殖的合適生物標志物[10]；miR-652是一個主要在骨髓調節中起作用的因子[11]，可能參與了免疫細胞炎癥信號的介導作用；miR-652可以通過靶向E盒結合鋅指蛋白1（ZEB1）來抑制胰腺癌細胞的上皮-間充質轉化[12]。

我們前期的研究結果發現miR-652在NSCLC中表達下降，并且促進NSCLC細胞凋亡。本實驗通過對以濃度變化和以不同時間的細胞計數觀察，發現miR-652的過表達對H460細胞增殖有抑制作用，且呈劑量依賴性和時間依賴性。我們還通過細胞劃痕實驗評價miR-652對H460細胞遷移的影響，發現miR-652能夠抑制H460細胞的遷移。而AMO-652的共轉染則取消了miR-652對細胞遷移的抑制作用。

Bcl-2家族蛋白分別具有抗凋亡作用（Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w、Mcl-1和A1/BFL-1）或促凋亡作用（Bax、Bak和Bok/MTD）。Bax基因位于19號染色體上，是Bcl-2基因家族中一個促進凋亡的成員。Bax在被激活后會引起細胞膜去極化、線粒體外膜通透性增加、線粒體孔開放和細胞色素C等線粒體內容物的漏出、線粒體腫脹和破裂，從而誘導下游細胞效應，最終導致細胞凋亡。caspase-9是caspases家族中的一員，是細胞凋亡信號的主要執行者。caspase-9一旦被激活，就能切割效應子caspase-3，從而誘導細胞凋亡相關的形態學和功能改變。越來越多的證據顯示caspase-9參與了細胞自噬的調控，是細胞凋亡和自噬之間平衡的重要決定因素[13]。

在癌癥的化療、放療和免疫治療期間，惡性腫瘤細胞可以通過激活細胞凋亡這一途徑而被破壞。Bax和caspase-9參與了腫瘤細胞的凋亡過程。誘導癌細胞凋亡的機制包括外在途徑和內在途徑。在細胞凋亡的外在途徑中，細胞表面的細胞受體接收到的信號激活了caspase-8。在細胞凋亡的內在途徑中，Bax被激活、表達增加，進而激活下游caspases。通過一系列caspases的級聯激活，caspase-2、caspase-3和caspase-9被激活。caspase2、3、9共同實現死亡信號的級聯放大，促進細胞凋亡。在實驗中我們進一步做了肺癌細胞凋亡蛋白的表達，檢測了miR-652對H460細胞中Bax和caspase-9蛋白表達的影響。我們發現miR-652的過表達促進了凋亡蛋白Bax和caspase-9的表達，而AMO-652的共轉染則取消了miR-652對凋亡蛋白表達的促進作用。由此可見，miR-652促進了凋亡蛋白的表達，并且至少是部分通過Bax和caspase-9起到抑癌作用。

以上這些數據表明miR-652的過表達可以抑制H460細胞生長和遷移，促進細胞凋亡，提示miR-652在H460細胞中起抑癌基因作用。以miR-652作為治療非小細胞肺癌H460的潛在靶點還需要進一步的體內實驗研究。

綜上所述，我們的研究結果表明miR-652在非小細胞肺癌H460組織中下調，miR-652在非小細胞肺癌H460細胞中具有抑癌作用。miR-652可能是非小細胞肺癌H460診斷、治療的新靶點。