醫(yī)用臭氧膀胱灌注治療大鼠膀胱炎的療效及安全性觀察

沙可夫，廖利民，劉鐵軍，王瑩，于春虎，曲文龍

1 首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 中國(guó)康復(fù)研究中心泌尿外科，北京100068；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院泌尿外科

近年來隨著生活環(huán)境變化，膀胱炎在感染性疾病中的發(fā)病率僅次于肺部感染，并呈現(xiàn)日益升高的趨勢(shì)[1-2]；而且，該病具有延綿難愈的特點(diǎn)，甚至可波及腎臟致其受損。因此，加強(qiáng)膀胱炎發(fā)生發(fā)展及治療的相關(guān)研究成為當(dāng)前泌尿外科著重關(guān)注的熱點(diǎn)[3]。據(jù)臨床觀察并結(jié)合大量資料分析顯示，致病性大腸埃希菌是導(dǎo)致膀胱炎發(fā)生發(fā)展的常見病原菌[4]，抗菌藥物雖能在一定程度滿足臨床治療所需，但近年來受抗生素廣泛使用及腸桿科細(xì)菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、碳?xì)涿瓜┟傅茸饔玫挠绊懀c桿科致病菌的多重耐藥性逐步升高[5]。研究顯示，大腸埃希菌對(duì)美羅培南、亞胺培南的耐藥率已分別達(dá)9.80%、7.30%[6]。這直接導(dǎo)致抗生素選擇的復(fù)雜化、風(fēng)險(xiǎn)化，治療效果降低，患者住院時(shí)間延長(zhǎng)、治療費(fèi)用增加。由此可見，抗生素的多重耐藥性極大限制了膀胱炎的治療手段，增加了臨床治療難度，所以亟需一種更為安全、高效的治療手段解決目前問題[7]。醫(yī)用臭氧作為一種強(qiáng)效氧化劑，因其具有抑制炎癥、鎮(zhèn)痛效果顯著并能激活細(xì)胞新陳代謝、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等功效，常被用于血管性疾病、感染性疾病、軟組織疾病和口腔疾病的治療且療效滿意[8]。但是，將其作為膀胱炎治療手段的報(bào)道及研究少見[9]。2019年3月—2020年4月，本研究建立膀胱炎大鼠模型，通過醫(yī)用臭氧對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，總結(jié)醫(yī)用臭氧作用效果、濃度使用安全窗及在減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)中的作用，為臨床推廣使用提供可參考的循證依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取96只清潔級(jí)(SPF)同月齡雌性健康Wistar大鼠[上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)部提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2020-0010]，體質(zhì)量240～260 g；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～27 ℃、濕度40%～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2019bkkyLW004)，全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照國(guó)家科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指導(dǎo)性意見》[10]進(jìn)行合理使用。

1.1.2 主要試劑和儀器 10%水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，生理鹽水(徐州萊恩藥業(yè)有限公司)，烏拉坦(上海山浦化功能有限公司)；大腸桿菌菌株ATCC35218(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)及DAB顯色試劑盒(上海佳和生物科技有限公司)；臭氧發(fā)生器(德國(guó)赫美斯)，JW-3021HR 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，JEOM-100CX 型透射電子顯微鏡(日本電子公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 醫(yī)用臭氧水配制 采用臭氧發(fā)生器使?jié)舛?0%的臭氧氣體分別以體積比1∶2、1∶1、1.5∶1溶解于無(wú)菌雙蒸餾水中，配制成質(zhì)量濃度分別為10、20、30 μg/mL的臭氧水，即配即用。

1.2.2 動(dòng)物分組與造模干預(yù)處理 分組采用按隨機(jī)數(shù)表法，取72只大鼠分為正常組(Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc亞組各12只)和治療組(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc亞組各12只)，另24只分為對(duì)照組和模型組各12只。模型組和治療組均經(jīng)尿道灌注大腸桿菌懸浮液進(jìn)行膀胱炎造模，正常組和對(duì)照組不進(jìn)行造模處理。造模方法：以10%水合氯醛按3 mL/kg予以腹腔麻醉，麻醉成功后定位大鼠膀胱；輕柔按壓膀胱促進(jìn)尿液排盡，對(duì)會(huì)陰、尿道外口及腹部予以消毒處理；采用1 mL注射器吸取足量細(xì)菌懸浮液，連接小兒靜脈留置針(24 G)；將小兒靜脈留置針自尿道外口插入膀胱，于30 s內(nèi)緩慢注入細(xì)菌懸液50 μL后退出導(dǎo)尿管。成模評(píng)定：7 d后各組隨機(jī)抽取2只，予以斷頸處死；切開腹腔，將膀胱取出且剪開，采用無(wú)菌拭子涂擦膀胱內(nèi)壁行細(xì)菌培養(yǎng)；同時(shí)將剪下的部分膀胱組織予以蘇木精—伊紅(HE)染色，制作病理切片。結(jié)果造模組和治療組細(xì)菌培養(yǎng)呈陽(yáng)性，可見膀胱黏膜顯著水腫、增厚，且黏膜、基質(zhì)存在單核炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、聚集及毛細(xì)血管充血、出血等，膀胱炎大鼠造模成功[11]。正常組和對(duì)照組細(xì)菌培養(yǎng)呈陰性，膀胱黏膜組織未見明顯病理改變。正常組的Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc亞組和治療組Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc亞組分別以10、20、30 μg/mL醫(yī)用臭氧水1 mL行膀胱灌注且保留30 min，模型組和對(duì)照組以等量生理鹽水行膀胱灌注，各組均連續(xù)灌注7 d。

1.2.3 醫(yī)用臭氧療效評(píng)價(jià) 模型組和治療組干預(yù)前后收集尿液，行尿液全項(xiàng)檢測(cè)。尿液細(xì)菌計(jì)數(shù)降至正常范圍內(nèi)為痊愈，細(xì)菌計(jì)數(shù)減少50%及以上為有效，細(xì)菌計(jì)數(shù)減少50%以下為無(wú)效[11]。總有效率=(痊愈+有效)只數(shù)/(痊愈+有效+無(wú)效)只數(shù)×100%。

1.2.4 尿流動(dòng)力學(xué)檢查 模型組、治療組收集完干預(yù)后的尿液，與對(duì)照組同時(shí)行尿流動(dòng)力學(xué)檢查。用25%烏拉坦2 mL/kg腹腔麻醉，經(jīng)尿道插入直徑1 mm硬膜外導(dǎo)管至膀胱，導(dǎo)管經(jīng)三通閥分別與尿動(dòng)力儀壓力傳感器及微量灌注泵相連；輕壓腹部，排空膀胱并標(biāo)記為0點(diǎn)[12]；以0.1 mL/min速度將生理鹽水灌注膀胱，并完成排尿間隔、膀胱容量、基礎(chǔ)膀胱壓力及最高膀胱壓力的測(cè)定。連續(xù)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.5 膀胱肌層組織TNF-α、IL-6、SOD、GSH-PX檢測(cè) 將模型組、治療組、對(duì)照組大鼠予以斷頸處死，切開腹腔并剪開膀胱，取新鮮膀胱肌層組織100 mg；加RIPA裂解液900 μL，冰浴勻漿至組織完全裂解；4 ℃下以2 000 g離心20 min，取上清液。ELISA法檢測(cè)膀胱組織中的TNF-α、IL-6濃度及SOD、GSH-PX活性，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6 醫(yī)用臭氧水濃度使用安全性評(píng)價(jià) 將正常組大鼠予以斷頸處死，切開腹腔并剪開膀胱，取膀胱組織樣本；采用石蠟包埋法行HE染色固定，顯微鏡下觀察膀胱黏膜、細(xì)胞等病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 醫(yī)用臭氧療效評(píng)價(jià)結(jié)果 治療組Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc總有效率依次增高且均高于模型組(P<0.05)，但各亞組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 醫(yī)用臭氧療效評(píng)價(jià)

2.2 模型組、治療組與對(duì)照組尿流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 三組基礎(chǔ)膀胱壓力、最高膀胱壓力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而排尿間隔、膀胱容量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療組內(nèi)Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc排尿間隔及Ⅱb、Ⅱc膀胱容量逐漸升高，且均高于模型組，但均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見表2。

表2 模型組、治療組與對(duì)照組尿流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

2.3 模型組、治療組與對(duì)照組膀胱肌層組織TNF-α、IL-6、SOD、GSH-PX檢測(cè)結(jié)果比較 各組膀胱肌層組織TNF-α、IL-6、SOD、GSH-PX檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療組內(nèi)Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc膀胱肌層組織TNF-α、IL-6表達(dá)量逐漸降低而SOD、GSH-PX活性逐漸增高，且TNF-α、IL-6表達(dá)量均低于模型組而SOD、GSH-PX活性均高于模型組，但TNF-α、IL-6表達(dá)量均高于對(duì)照組而SOD、GSH-PX活性均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見表3。

表3 模型組、治療組與對(duì)照組膀胱肌層組織TNF-α、IL-6、SOD、GSH-PX檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 醫(yī)用臭氧水濃度使用安全性評(píng)定結(jié)果 正常組Ⅰa、Ⅰb均未出現(xiàn)明顯病理改變，Ⅰc中1只出現(xiàn)明顯病理改變。病理改變?yōu)殓R下可見黏膜水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張，組織內(nèi)可見炎癥現(xiàn)象，存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)延伸至肌層。

3 討論

近年來，有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與了膀胱炎的發(fā)生發(fā)展[13]。其中，氧化應(yīng)激作為氧化物質(zhì)與抗氧化物質(zhì)間的對(duì)抗反應(yīng)，被視為是啟動(dòng)和加速炎癥反應(yīng)的催化劑和有效媒介[14]；一旦炎癥反應(yīng)被啟動(dòng)和加速，就能誘發(fā)膀胱組織內(nèi)TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生與過度表達(dá)，致使膀胱內(nèi)局部組織微環(huán)境異常，繼而引起膀胱組織損傷，影響其正常功能[15]。由此可見，促進(jìn)抗氧化物質(zhì)表達(dá)，有利于遏制和減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，繼而有助于阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)膀胱組織的損傷過程，可視為治療膀胱炎的有效途徑之一[16-17]。

醫(yī)用臭氧為醫(yī)用純氧制備的臭氧與純氧的混合氣體，能夠有效改善局部組織微循環(huán)，影響毛細(xì)血管擴(kuò)張狀態(tài)，增加組織細(xì)胞膜通透性，提升血流速度，繼而增加組織供氧、減少炎性滲出[18]；同時(shí)局部組織供氧能力的提升，有利于促進(jìn)受損細(xì)胞快速完成自身修復(fù)與增殖[19]。另外，醫(yī)用臭氧存在著非特異性和特異性抑制病原微生物生長(zhǎng)等作用，使其具有良好的抗感染特性[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)，臭氧注射治療對(duì)創(chuàng)傷后無(wú)菌炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用，且能促進(jìn)創(chuàng)傷軟組織的修復(fù)[21]。孫妞妞等[22]研究發(fā)現(xiàn)，臭氧水對(duì)輸卵管及宮頸的炎癥具有良好的殺菌效果。而趙超莉等[23]研究顯示，臭氧氣浴30 min和60 min對(duì)大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等的殺菌率均達(dá)到100%。以上研究均提示，醫(yī)用臭氧具有強(qiáng)大的殺菌作用。基于此，本研究通過對(duì)不同灌注濃度醫(yī)用臭氧治療大鼠膀胱炎模型的效果以及對(duì)抗氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、GSH-PX)和炎癥反應(yīng)指標(biāo)(TNF-α、IL-6)的影響進(jìn)行分析，旨在為醫(yī)用臭氧治療膀胱炎的可行性提供依據(jù)，并初步探討其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，不同灌注濃度醫(yī)用臭氧尤其是20、30 μg/mL時(shí)治療膀胱炎大鼠的總有效率及排尿間隔、膀胱容量均高于模型組，體現(xiàn)了醫(yī)用臭氧良好的殺菌作用，并能有效改善尿頻、尿急等癥狀。對(duì)炎癥反應(yīng)的影響方面，治療組隨著灌注濃度的增加，大鼠膀胱肌層組織TNF-α、IL-6表達(dá)水平較模型組逐漸降低。這表明醫(yī)用臭氧能顯著改善膀胱炎大鼠膀胱組織的炎癥狀況，且濃度越高效果越好。在對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)影響方面，模型組膀胱肌層組織SOD、GSH-PX活性較對(duì)照組降低，治療組20、30 μg/mL時(shí)膀胱肌層組織SOD、GSH-PX活性較模型組升高。這提示膀胱炎大鼠膀胱組織存在抗氧化指標(biāo)活性下降，而醫(yī)用臭氧灌注能促進(jìn)抗氧化指標(biāo)活性的恢復(fù)。因此，醫(yī)用臭氧可能通過阻斷氧化應(yīng)激反應(yīng)使氧化與抗氧化水平重新實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，有利于降低或避免炎癥物質(zhì)過度產(chǎn)生以發(fā)揮和擴(kuò)大其抗炎效應(yīng)，繼而避免膀胱組織結(jié)構(gòu)的損傷及其功能的失常。這進(jìn)一步闡明了醫(yī)用臭氧在膀胱炎治療中的作用機(jī)制，為其推廣使用提供了可靠的理論依據(jù)。

盡管醫(yī)用臭氧具有可靠的治療價(jià)值與良好的應(yīng)用前景，但本結(jié)果還顯示使用高濃度(30 μg/mL)醫(yī)用臭氧7 d可誘發(fā)正常大鼠膀胱黏膜水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張、組織內(nèi)可見炎癥現(xiàn)象等。這可能與臭氧具有強(qiáng)烈的氧化作用易使組織氧化受損有關(guān)，且組織受損程度與臭氧使用時(shí)間具有正相關(guān)性[24]；雖然該濃度與其他濃度相比無(wú)顯著差異，但其所引起的膀胱黏膜受損等病理改變?nèi)孕枰鹱銐蛑匾暎悦庠斐啥螕p傷。

綜上所述，短時(shí)間內(nèi)應(yīng)用不同濃度醫(yī)用臭氧對(duì)大鼠膀胱炎均有較好的殺菌效果，并能在一定程度上減輕尿頻、尿急等癥狀，減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，尤以20、30 μg/mL時(shí)最為顯著；但是，高濃度的醫(yī)用臭氧使用仍需權(quán)衡利弊、慎重選取，方能取得利益最大化。