miR-369-3p在山荷葉素調控甲狀腺癌細胞增殖、遷移中的作用

王雪，鮑敏麗，姚炳山

1 秦皇島市中醫醫院藥劑科，河北秦皇島066000；2 秦皇島市中醫醫院急診科

甲狀腺癌是臨床常見的一種內分泌器官惡性腫瘤，我國甲狀腺癌發病率逐年上升。由于甲狀腺癌具有隱匿性，導致大部分患者失去最佳治療時機[1-2]。研究表明，部分中草藥具有抗甲狀腺癌作用，但其具體作用機制尚未闡明[3-4]。山荷葉素是中藥山荷葉提取物的主要成分，具有抗腫瘤作用。研究表明，山荷葉素可抑制卵巢上皮細胞癌細胞遷移及侵襲[5]，但山荷葉素與甲狀腺癌的相關研究報道相對較少。微小RNA(miRNA)可通過靶向調控靶基因表達而調節細胞增殖及凋亡等生物學行為。研究表明，miR-369-3p在乳頭狀甲狀腺癌中表達下調，上調其表達可抑制細胞遷移及侵襲[6]。但是，miR-369-3p是否可作為山荷葉素治療甲狀腺癌的潛在靶點尚未可知。2020年1月—12月，我們探討了山荷葉素是否可通過靶向調控miR-369-3p表達而影響甲狀腺癌細胞生物學行為。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 山荷葉素購自成都儀睿生物科技有限公司(純度>98%)；人甲狀腺癌細胞SW579購自美國ATCC；DMEM培養基、胎牛血清、CCK-8試劑、TRIzol試劑購自上海碧云天生物；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化；miR-NC、miR-369-3p mimic、anti-miR-NC、miR-369-3p Inhibitor購自廣州銳博生物。

1.2 山荷葉素對甲狀腺癌細胞增殖、遷移及miR-369-3p表達影響的觀察

1.2.1 細胞分組與處理 SW579細胞接種于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基內培養，取對數生長期SW579細胞(2.5×105/mL)接種于6孔板，每孔200 μL；山荷葉素2.5 μmol/L組、5.0 μmol/L組、10.0 μmol/L組分別加入含2.5、5.0、10.0 μmol/L山荷葉素的DMEM培養基[7]培養24 h，將正常培養的SW579細胞為對照組，每組均設3個復孔。

1.2.2 細胞增殖情況觀察 ①CCK-8實驗：取各組SW579細胞(1×104/mL)接種于96孔板，每孔200 μL；每孔中加入CCK-8溶液10 μL，于培養箱內繼續培養2 h；應用酶標儀檢測各孔450 nm時的光密度值(OD)，并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(對照孔OD-實驗孔OD)/(對照孔OD-空白孔OD)×100%。實驗重復3次，取平均值。②平板克隆形成實驗：收集各組SW579細胞接種于6孔板，每孔5×102個細胞；培養箱內培養14 d，棄培養基，預冷PBS洗滌；加入500 μL甲醇固定20 min，1%結晶紫染色液染色15 min，蒸餾水洗滌后晾干。于顯微鏡下觀察對≥30個細胞的集落，計算細胞克隆形成數。實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。細胞鋪板前用馬克筆在24孔板的背面筆直地畫出3條橫線做標記。取各組SW579細胞(2×105/mL)接種于6孔板，每孔200 μL；待細胞長滿時，采用20 μL槍頭垂直于孔板背面的橫線畫出一條筆直的道痕，PBS洗滌劃痕產生的細胞碎片。以此記時為0 h，拍照后將培養板放入培養箱內繼續培養24 h取出拍照，根據劃痕寬度變化計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.2.4 細胞中miR-369-3p表達檢測 采用qRT-PCR法。采用TRIzol試劑分別提取各組SW579細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。PCR擴增反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補足體系至20 μL。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-369-3p相對表達量。miR-369-3p正向引物5′-CTCCTGGTACCTGAAGGGAGA-3′，反向引物5′-CTCCAAGGTGAGATTTGATACTGA-3′；U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.3 miR-369-3p對SW579增殖、遷移影響的觀察 采用脂質體轉染法將miR-NC、miR-369-3p mimic分別轉染至SW579細胞，分別記為miR-NC組、miR-369-3p mimic組。按照“1.2.2”的方法觀察細胞增殖情況，按照“1.2.3”的方法觀察細胞遷移能力，按照“1.2.4”的方法檢測細胞中的miR-369-3p。

1.4 抑制miR-369-3p對山荷葉素調控SW579增殖、遷移影響的觀察 采用脂質體轉染法將anti-miR-NC、miR-369-3p Inhibitor轉染至SW579細胞，轉染成功后加入含10.0 μmol/L山荷葉素的DMEM培養基培養24 h，分別記為山荷葉素+anti-miR-NC組、山荷葉素+miR-369-3p Inhibitor組。按照“1.2.2”的方法觀察細胞增殖情況，按照“1.2.3”的方法觀察細胞遷移能力，按照“1.2.4”的方法檢測細胞中的miR-369-3p。

2 結果

2.1 山荷葉素對SW579增殖、遷移的影響 與對照組比較，山荷葉素2.5 μmol/L組、5.0 μmol/L組、10 μmol/L組細胞增殖抑制率均逐漸升高，細胞克隆形成數逐漸減少，劃痕愈合率逐漸降低(P均<0.05)。見表1。

表1 荷葉素對SW579增殖、遷移的影響

2.2 山荷葉素對SW579中miR-369-3p表達的影響 與對照組(1.00±0.00)比較，山荷葉素2.5 μmol/L組、5.0 μmol/L組、10.0 μmol/L組miR-369-3p的表達量逐漸升高，分別為1.57±0.06、2.28±0.08、3.09±0.12(P均<0.05)。

2.3 miR-369-3p對SW579增殖、遷移的影響 與miR-NC組比較，miR-369-3p mimic組細胞中miR-369-3p表達增加，細胞增殖抑制率升高，細胞克隆形成數減少，劃痕愈合率降低(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-369-3p對SW579增殖、遷移的影響

2.4 抑制miR-369-3p對山荷葉素調控SW579增殖、遷移的影響 與山荷葉素+anti-miR-NC組比較，山荷葉素+miR-369-3p Inhibitor組中miR-369-3p表達減少，細胞增殖抑制率降低，細胞克隆形成數增多，劃痕愈合率升高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 抑制miR-369-3p對山荷葉素調控SW579增殖、遷移的影響

3 討論

甲狀腺癌發病機制較為復雜，癌基因活化或抑癌基因失活等均可能促進甲狀腺癌的發生及發展。既往研究顯示，部分中草藥及其活性成分可通過調控多個基因或信號通路表達而發揮抗甲狀腺癌作用[8-9]。miRNA在甲狀腺癌中表達異常，并可影響甲狀腺癌細胞生物學行為，還可能作為甲狀腺癌靶向治療的潛在靶點[10-11]。但是，miRNA是否可作為中草藥治療甲狀腺癌的潛在靶點尚未完全闡明。

山荷葉也被稱為窩兒七，是一種在秦巴地區民間廣泛使用的草藥，具有“破血生肌、解熱鎮痛消炎、刺激腸蠕動”的功效。現代藥理研究表明，山荷葉包含木脂素類、黃酮類等活性成分，顯現出良好的除疣、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、鎮痛等活性，臨床常用于治療風濕性關節炎、腰腿疼痛、骨蒸潮熱、跌打損傷、月經不調等[12]。山荷葉素是芳基萘類木脂素家族的天然化合物，具有促進血液循環、解毒消腫和改善糖脂代謝的作用，在結直腸腺癌細胞CaCo-2中顯示出良好的抗病毒活性[13]。最近的研究發現，山荷葉素還具有抗腫瘤作用。例如：山荷葉可抑制食管癌細胞TE-1和ECA-109的增殖、遷移、腫瘤血管形成，并誘導S期細胞周期阻滯[14]；山荷葉素作為新型V-ATPase抑制劑，顯著抑制人胃癌細胞SGC7901的增殖并誘導其凋亡[15]；山荷葉素對宮頸癌HeLa、肺癌A549和H460細胞也顯示出細胞毒性[16]。但是，山荷葉素對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響尚未可知。本研究結果顯示，隨著山荷葉素濃度升高，甲狀腺癌細胞增殖抑制率逐漸增高，克隆形成數逐漸減少，劃痕愈合率逐漸降低。這表明山荷葉素可抑制甲狀腺癌細胞增殖、克隆形成及遷移，提示與此前報告的抗腫瘤活性[14-15]類似。因此，山荷葉素有可能作為甲狀腺癌的抑癌劑，但其具體作用機制尚不清楚

本研究進一步探究山荷葉素抗甲狀腺癌的作用機制，結果隨著山荷葉素濃度的升高，甲狀腺癌細胞中miR-369-3p表達量逐漸升高，提示山荷葉素有可能通過促進miR-369-3p表達而發揮抗甲狀腺癌作用。miR-369-3p表達失調已在許多疾病中被報道，包括癌癥。例如：miR-369-3p在甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌組織中表達水平降低，其下調與甲狀腺癌患者較低的生存率相關；上調miR-369-3p可抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖,機制與靶向下調其靶標TSPAN13有關[17]。miR-369-3p在肝細胞癌組織和細胞中呈低表達，上調其表達可抑制肝細胞癌細胞生長及轉移，這種抗肝細胞癌的作用是通過抑制PAX6表達來實現的[18]。miR-369-3p在前列腺癌細胞中表達下調，上調其表達可抑制前列腺癌細胞增殖及遷移，其中CFL2被證實是miR-369-3p的下游靶基因[19]。這些研究表明，在腫瘤發生及發展過程中,miR-369-3p可能通過對抗腫瘤細胞的增殖、轉移等特性而發揮抑癌基因的作用。本研究結果顯示，miR-369-3p過表達可減弱甲狀腺癌細胞增殖、克隆形成及遷移能力，與前述報告相吻合。此外，抑制miR-369-3p表達可拮抗山荷葉素對甲狀腺癌細胞增殖、克隆形成及遷移的抑制作用，提示山荷葉素可能通過促進miR-369-3p表達而抑制甲狀腺癌發展進程。根據上述報道，miR-369-3p實現抗癌功能與靶向不同的下游靶標(TSPAN13、PAX6、CFL2等)有關，推測本研究中miR-369-3p對甲狀腺癌的作用也與這些靶標聯系密切。

綜上所述，山荷葉素可通過上調miR-369-3p表達抑制甲狀腺癌細胞增殖、克隆形成及遷移，miR-369-3p可能作為山荷葉素治療甲狀腺癌的潛在靶點。但是，山荷葉素是否通過調控其他基因或信號通路表達發揮抗甲狀腺癌作用尚需進一步探究。