紫檀芪灌胃對大鼠心肌肥厚的改善作用及其分子機制

董文婷，尚福軍，郭錦，劉慧，劉艷麗

1 西安國際醫學中心醫院心臟內科，西安710100；2臨汾經濟技術開發區新立醫院內科；3空軍軍醫大學唐都醫院心內科

心肌肥厚主要表現為心肌細胞體積的大幅增加，可分為生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚兩種類型[1]。病理性心肌肥厚可導致心輸出量不足，是慢性心力衰竭進展的關鍵因素，可作為慢性心力衰竭發展的預測因子[2]。因此，預防心肌肥厚的發生可能對抑制慢性心力衰竭的發展和改善慢性心力衰竭患者的預后具有重要意義。紫檀芪(PTE)是從藍莓等天然植物中分離出的一種二苯乙烯化合物，具有抗炎、抗氧化及神經保護等多種生物學活性[3]。研究顯示，PET在心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化等心血管系統相關疾病中展現出了積極的治療作用，并且這種作用與其抗氧化能力密切相關[4-5]。氧化應激是指機體活性氧(ROS)產生過多和(或)機體抗氧化能力降低導致潛在性損傷的生理過程，與心血管疾病的發生發展存在密切關系。SIRT3是線粒體中的一個重要的去乙酰化修飾酶，可直接或間接地去乙酰化其下游靶點FOXO3a，促進抗氧化基因表達，從而發揮其抗氧化應激的作用。2021年3月—9月，本研究通過建立大鼠心肌肥厚模型觀察PET對心肌肥厚的改善作用，并探討其分子機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 清潔級8周齡雄性SD大鼠40只，體質量180～200 g，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(軍)2007-007。PTE(貨號:PHL83261)、SIRT3特異性阻斷劑3-TYP(貨號：567860)均購自美國Sigma公司，超氧化物陰離子熒光探針(DHE,貨號：D23107)購自美國Invitrogen公司；一抗SIRT3(ab189860)、FOXO3a去乙酰化后產物Ac-FOXO3a(ab154786)、抗氧化蛋白NOX2(ab129068)、氧化應激標志蛋白gp91phox(ab238964)抗體均購自英國Abcam公司，一抗β-actin抗體及二抗羊抗兔、羊抗鼠均購自北京中杉金橋公司。

1.2 動物建模與分組處理 40只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、PTE組、PTE+3-TYP組，每組10只。除假手術組外均采用腹主動脈縮窄術建立大鼠心肌肥厚模型：使用30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后置于操作臺，劍突下沿腹中線作長約3 cm的切口打開腹腔，逐層分離皮下組織并暴露腹主動脈及腎動脈，在腎動脈上0.6 cm處用絲線將腹主動脈與7號針頭結扎，使腹主動脈縮窄至0.7 mm，隨即抽出針頭，逐層關腹，并常規使用青霉素預防傷口感染。假手術組除開腹時不結扎腹主動脈以外，其他步驟均同建模組相同。PTE組和3-TYP+PTE組大鼠術后給予每日100 mg/kg PTE灌胃處理，3-TYP+PTE組大鼠在給予PTE灌胃處理同時經腹腔給予50 mg/kg的3-TYP注射，假手術組及模型組大鼠給予相同體積生理鹽水灌胃，一直處理8周為實驗終點。

1.3 心功能檢查 ①血流動力學：將各組大鼠使用30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后置于操作臺，大鼠頸部皮膚脫毛，右頸部作一小切口以暴露右側頸總動脈，將充滿肝素的導管一端插入頸總動脈內直至進入左心室，另一端與壓力傳感器相連，密切觀察大鼠心率及壓力波形的變化并記錄左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室收縮末期壓力(LVESP)、等容收縮期左心室內壓力上升的最大速率(+dp/dt)和等容舒張期左心室壓力下降的最大速率(-dp/dt)等血流動力學心功能參數。②血清B型利鈉肽(BNP)水平：頸動脈采集大鼠1 mL血液室溫靜置后收集上層血清。采用ELISA法將待測樣品用樣品稀釋液按4∶1稀釋比稀釋，已稀釋的待測樣品加入到ELISA試劑盒中的標準品中，再將酶標試劑加入各孔，放入37 ℃水浴鍋內孵育60 min。每孔中先后加入顯色劑A和B，混勻后繼續置于37 ℃水浴鍋內避光顯色15 min。加入終止液以終止反應，將空白孔調零后于酶標儀內進行測定，在450 nm波長處檢測各孔的吸光度值。

1.4 心肌肥厚指標檢測 ①心臟指數：心功能檢查后立即使用電子天平稱取大鼠體質量，處死大鼠并迅速摘取心臟及脛骨，PBS溶液洗滌后測量整個心臟的濕質量及脛骨長度。心臟指數用心臟重量與體質重(HW/BW)和心臟重量與脛骨長度(HW/TL)的比值來表示。②心肌細胞橫截面積：采用麥胚凝集素(WGA)染色法。大鼠處死后，用組織剪取出心臟，后用生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干殘留液體，使用手術刀片切取部分左心室心臟組織置于4%多聚甲醛內固定并制備成5 μm的石蠟切片，經脫蠟至水、抗原修復后滴加WGA工作液，37 ℃恒溫箱孵育30 min后染核封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個不同視野留存，用Image J軟件分析結果。

1.5 心肌組織ROS生成量觀察 采用DHE染色法。大鼠處死后，用組織剪取出心臟，后用生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干殘留液體，使用手術刀片切取部分左心室心臟組織，經冰凍切片包埋劑包埋后制備成5 μm的冰凍切片，經PBS溶液洗滌后避光滴加DHE染液，37 ℃恒溫箱孵育15 min后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。隨機選取5個不同視野留存，用Image J軟件分析結果。

1.6 心肌組織SIRT3、Ac-FOXO3a、NOX2及gp91phox蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將心臟組織稱重，切小塊放入EP管中。配置含抑制劑的蛋白質抽提試劑(1 mL抽提試劑中加入5 μL蛋白酶抑制劑混合液，5 μL PMSF和5 μL磷酸酶混合液)。加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提試劑(250 mg組織中加入1 mL抽提試劑)。用勻漿器每次30 s低速勻漿，至組織完全裂解。裂解液于預冷的離心機中14 000 r/min離心15 min。上清液用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。將30 μg蛋白樣品經凝膠電泳分離后轉移到PVDF膜上，隨后用SIRT3(1∶1 000)、Ac-FOXO3a(1∶500)、NOX2(1∶1 000)、gp91phox(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗和相應的二抗(1∶5 000)孵育，使用化學發光試劑和凝膠成像系統進行蛋白半定量分析，以目的蛋白與內參光密度比值表示其相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 各組大鼠LVEDP、LVESP、血清BNP水平比較，模型組、PTE+3-TYP組>PTE組>假手術組；+dp/dt、-dp/dt比較，模型組、PTE+3-TYP組

表1 各組大鼠心功能指標比較

2.2 各組大鼠心肌肥厚指標比較 各組大鼠心肌肥厚指標HM/TL、HM/BM、心肌細胞橫截面積比較，模型組、PTE+3-TYP組>PTE組>假手術組(P均<0.05)，模型組與PTE+3-TYP組各心臟指數比較差異均無統計學意義。見表2。

2.3 各組大鼠心肌ROS生成量比較 假手術組、模型組、PTE組、PTE+3-TYP組大鼠心肌ROS生成量分別為102.37±9.74、246.73±36.24、155.46±28.25、228.73±34.68，模型組、PTE+3-TYP組>PTE組>假手術組(P均<0.05)，模型組與PTE+3-TYP組比較差異無統計學意義。

表2 各組大鼠心肌肥厚指標比較

2.4 各組大鼠心肌組織SIRT3、Ac-FOXO3a、NOX2及gp91phox蛋白表達比較 各組大鼠SIRT3、NOX2蛋白表達比較，模型組、PTE+3-TYP組PTE組>假手術組(P均<0.05)，模型組與PTE+3-TYP組比較差異均無統計學意義。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織SIRT3、Ac-FOXO3a、NOX2及gp91phox蛋白表達比較

3 討論

心肌肥厚是心臟對主動脈瓣狹窄、高血壓和擴張型心肌病等心血管疾病所致負荷增加的一種適應性反應，病理性心肌肥厚以心肌細胞肥大和心肌收縮力紊亂為特征，是心力衰竭的一個重要誘發因素[6]。因此，迫切需要一種能改善心肌肥厚癥狀及延緩心肌肥厚進展的治療藥物。本研究通過腹主動脈縮窄術建立了大鼠心肌肥厚模型，觀察到與假手術組大鼠比較，模型組大鼠心臟指數HM/TL和HM/BM上升，心肌細胞橫截面積及血清BNP水平增加，心功能參數LVEDP、LVESP上升，+dp/dt、-dp/dt降低。在給予PET藥物處理后可逆轉模型組大鼠心臟體積增大及心肌細胞肥大，降低心肌肥厚以及心力衰竭標志分子BNP的釋放，同時提高模型組大鼠心臟收縮功能。以上結果提示，PET可改善腹主動脈縮窄導致的大鼠心肌肥厚，其有作為心肌肥厚保護藥物的潛力。

多項研究顯示，氧化應激損傷是動脈粥樣硬化、糖尿病心肌病、心肌梗死后心肌重構和心力衰竭等心臟相關疾病發病的重要原因[7-8]。此外，ROS水平的增加也被認為是心臟病理改變和組織變性的主要驅動因素[9]。ROS作為第二信使和信號轉導調控因子，是心肌肥厚的關鍵觸發因子，而且ROS的產生可刺激基質金屬蛋白酶的表達和翻譯后激活，進而刺激心臟成纖維細胞增殖[10]。研究發現，一些心肌肥厚信號分子如PKC、JNK、ERK1/2、AKT、MAPKs、NF-κB等也會因ROS生成的增加而被激活[11]。因此，氧化應激可導致心肌細胞肥大，繼而重塑心肌組織結構并最終影響心臟功能。PET是一種具有抗氧化能力的天然多酚類化合物，可減輕多種因素所致的組織器官損傷。彭艷芳等[12]發現，PET能有效緩解肺纖維化，其機制可能與減弱氧化應激反應有關。馮麗娜等[13]研究顯示，PET可通過拮抗成骨細胞氧化應激損傷為股骨頭缺血性壞死的治療提供理論基礎。XU等[14]研究發現，PET可通過抑制氧化應激治療變異性哮喘。本研究同樣觀察到，與假手術組大鼠比較，模型組大鼠心肌組織抗氧化蛋白NOX2下降、氧化應激標志蛋白gp91phox及ROS生成量上升。給予PET藥物處理后，PTE組大鼠心肌組織NOX2蛋白表達升高，gp91phox蛋白表達及ROS生成量下降，氧化應激水平降低。以上結果提示，PET可通過抑制心肌組織氧化應激損傷進而發揮心肌肥厚的保護作用。

既往研究顯示，乙酰化酶家族在調節機體能量代謝、細胞衰老、細胞凋亡及腫瘤形成等方面發揮重要的作用。SIRT3主要存在于線粒體內，可調節其下游靶點FOXO3a發揮去乙酰化作用，促進抗氧化基因的表達，進而增強ROS的清除，因此SIRT3的表達與激活能通過其抗氧化效應發揮抗氧化應激作用[15-16]。近年來研究發現，SIRT3是心肌肥厚重要的保護性蛋白。周海佳等[17]發現，金絲桃苷能夠通過激活SIRT3信號減輕心肌組織的氧化應激損傷，抑制心肌纖維化進展，改善壓力負荷引起的病理性心肌肥厚。熊朝剛等[18]研究顯示，黃芪甲苷可通過激活SIRT3抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥厚及氧化應激。CHEN等[19]發現，過表達SIRT3可抑制心肌纖維化信號通路，改善心臟收縮功能，進而抑制心肌肥厚。本研究結果顯示，與假手術組大鼠比較，模型組大鼠心肌組織SIRT3蛋白表達下降，FOXO3a乙酰化程度上升。給予PET藥物處理后，PTE組大鼠心肌組織SIRT3蛋白表達增加，FOXO3a乙酰化程度降低。進一步給予SIRT3特異性抑制劑3-TYP發現，阻斷SIRT3信號不僅可以逆轉PTE對大鼠心肌組織SIRT3信號的激動作用，同時也逆轉了PET的上述心肌肥厚保護作用。以上結果提示，SIRT3/FOXO3a信號通路是PET抗心肌肥厚作用中的關鍵分子靶點。

綜上所述，本研究發現PET可以通過減輕心肌組織氧化應激損傷改善大鼠腹主動脈縮窄所致的心肌肥厚，并且這種作用可能是通過激活SIRT3/FOXO3a信號通路實現的。PET有望成為預防和治療心肌肥厚、改善心功能的潛在藥物，值得在臨床進一步推廣。