PM2.5處理后的小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞基因表達譜變化及其功能與信號通路分析

吳秋秋，劉兆宇，李本，殷威達，楊志凱，陳紀濤，劉季芳

廣州醫科大學附屬第五醫院 廣州市加速康復腹部外科重點實驗室，廣州510700

空氣污染對人類健康造成了巨大威脅，空氣中顆粒物與呼吸道疾病的發生存在密切聯系[1-2]。直徑為2.5 μm的細顆粒物(PM2.5)相對于空氣中的其他顆粒物粒徑更小、表面積更大、質量更輕，且能逃避氣管細胞纖毛等過濾作用直接沉積至肺泡，可介導哮喘、慢性阻塞性肺疾病等呼吸道疾病，甚至誘發惡性腫瘤[3]。本課題組前期通過透射電鏡觀察了不同濃度PM2.5處理的小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞MLE-12，發現PM2.5對MLE-12細胞有一定的毒性作用。進一步檢測經PM2.5處理后MLE-12細胞中的上皮細胞標志物E-cadherin、間質細胞標志物Vimentin，發現PM2.5可能通過促進肺泡上皮細胞的上皮—間質轉化導致正常細胞的惡性轉變。轉錄組測序可使用基于二代測序技術的Illumina測序平臺檢測組織或細胞在特定時間或者處理之后轉錄的所有mRNA，為基因功能的研究及疾病的預防和治療提供科學依據[4]。2020年10月—2021年3月，本研究使用轉錄組測序進分析PM2.5處理后MLE-12細胞的基因表達譜變化，并通過GO及KEGG分析差異表達基因功能與富集的信號通路，為PM2.5造成的細胞毒性及致癌機制的進一步研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞MLE-12購自中國科學院細胞庫。PM2.5購自美國Sigma公司，胎牛血清、DMEM培養基購自美國Gibco公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，異丙醇、氯仿購自天津市大茂化學試劑廠，細胞計數板購自上海Countstar公司，6孔細胞培養板、100 mm細胞培養皿購自美國Corning公司。多功能酶標儀購自美國Bio TEK公司，細胞計數儀購自上海Countstar公司、qRT-PCR系統購自美國Bio-Rad公司，熒光定量PCR儀購自美國Invitrogen公司，雙模塊PCR儀購自美國Perkin Elmer Cetus公司。

1.2 MLE-12細胞分組與PM2.5處理 將MLE-12細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養至對數生長期后，棄去培養基，用PBS清洗3次，胰酶消化后低速離心5 min，加入DMEM培養基將沉淀混勻后進行細胞計數，以7×105/孔接種于6孔板，搖勻后放入5% CO2、37 ℃恒溫細胞培養箱培養過夜。將細胞分為PM2.5組及對照組，PM2.5組用含2%胎牛血清DMEM高糖培養基配制成的100 μg/mL PM2.5溶液處理細胞24 h，對照組不作任何處理。PM2.5毒性劑量選擇的主要依據為前期課題組研究結果以及MPPD生物計算機模型計算出的PM2.5在正常人體氣管、支氣管區域24 h內的實際沉積量。

1.3 PM2.5處理后MLE-12細胞差異表達基因篩選

1.3.1 RNA提取 將兩組細胞PBS洗滌3次，每孔細胞加入1 mL TRIzol，用槍頭混勻后移至EP管，冰上放置5 min，含1 mL TRIzol的每支EP管分別加入200 μL氯仿，用力震蕩15 s，靜置冰上15 min后再以12 000 r/min 4 ℃離心15 min。將上層水層轉移到新的EP管，并將水層等體積的異丙醇加入EP管混勻，室溫靜置10 min，再以12 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清后每1 mL的TRIzol加入1 mL的75% 乙醇進行清洗，再棄去上清靜置15 min，加入Rnase-free H2O溶解RNA沉淀，保存在-80 ℃冰箱，送樣至諾和致源公司測序。

1.3.2 轉錄組測序 將片段mRNA做模版，隨機寡核苷酸做引物，合成cDNA第一條鏈。在DNA polymerase Ⅰ體系中，dNTPs做為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復、加A尾并連接測序接頭，篩選出250～300 bp的cDNA用于PCR擴增，純化PCR產物，最終獲得基因文庫。基因文庫構建完成后，先進行初步定量，再用q-PCR對文庫有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度高于2 nmol/L)，確保文庫質量合格。為確保信息分析質量合格，獲得原始數據后需經過原始數據過濾、測序錯誤率檢查、GC含量分布檢查，獲得供分析的堿基數(clean reads)來保證信息分析質量。評估質量后，使用HISAT2軟件將過濾后的兩組測序數據與參考基因組進行比較分析。測序產出數據質量顯示，過濾后數據中的clean reads數據在6.0～7.0 G，錯誤率約為0.03，Q20(堿基正確識別率為99%)和Q30(堿基正確識別率為99.9%)均大于90%，G、C堿基含量在正常范圍內。將本研究的兩組測序數據經過濾后與參考基因組比對，發現比對到基因組上讀段數的比例均大于95%(一般高于70%)，比對到多位置的讀段數比例均小于5%(一般低于10%)，比對到惟一位置的讀段數比例均大于92%，提示數據合格，可用于進一步分析。

1.3.3 差異表達基因分析 使用edgeR軟件進行差異表達基因分析。首先標準化兩組測序數據原始的readcount(主要為矯正測序深度)，用統計學模型計算假設檢驗概率，使用多重假設檢驗校正得到FDR值(Padj)，以Padj<0.05為閾值作為篩選兩組樣本差異表達基因的標準。

1.4 差異表達基因的功能與信號通路分析 使用clusterProfile軟件進行差異基因的GO功能富集和KEGG通路富集分析。將差異表達基因分析后所得的差異基因注釋到GO或KEGG數據庫的基因集中進行富集，以Padj<0.05作為顯著性富集的閾值。

1.5 差異表達基因的驗證 我們選擇了KEGG富集分析中化學致癌通路的10個較感興趣的差異表達基因進行差異表達驗證，采用q-PCR法檢測其mRNA表達。收集對數生長期的兩組細胞，提取細胞總RNA，用PrimeScript RT reagent kit將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板通過TB Green Premix Ex Taq Ⅱ進行PCR擴增。取2 μL cDNA、10 μ L TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、6 μL ddH2O、6 μL ROX Reference Dye Ⅱ、0.8 μL正向引物及0.8 μL反向引物于EP管中，構成20 μL反應體系。反應條件:95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。以GAPDH為內參，按2-ΔΔCt計算差異表達基因的相對表達量。引物序列見表1。分別計算各基因通過q-PCR法、轉錄組測序得到的PM2.5組/對照組比值，若比值>1表明該基因經PM2.5處理后表達升高，比值<1則表明該基因經PM2.5處理后表達下降。對比q-PCR法測出的基因表達變化是否與轉錄組測序測出的基因表達變化一致，以驗證測序的準確性。

表1 差異表達基因及內參基因引物序列

2 結果

2.1 兩組差異表達基因篩選結果 共篩選到1 151個差異表達基因，其中下調基因的數量為688個，上調基因數量為483個。差異基因火山圖、差異基因聚類分析圖見OSID碼圖1、2。

2.2 差異表達基因的功能與信號通路分析結果 對差異基因進行GO分析，發現差異基因主要參與的生物過程有調節趨化作用、小分子代謝過程、膽固醇代謝過程、二價無機陽離子穩態等；主要細胞成分為細胞外基質、蛋白質的細胞外基質、膠原蛋白三聚物、細胞外基質成分、填隙基質等；主要分子功能為鈣離子結合、肝素結合、細胞外基質結構成分、糖胺聚糖結合、谷胱甘肽轉移酶活性等(表2)。對差異基因進行KEGG信號通路富集分析，發現差異基因富集的信號通路主要為細胞外基質—受體交互、細胞色素P450對異種生物的代謝、黏附點、蛋白質消化吸收、類固醇生物合成、谷胱甘肽代謝、化學致癌性、藥物代謝(細胞色素P450)等信號通路(表3)。

表2 差異表達基因的GO功能分析結果(按P值排序的前8位)

表3 差異表達基因的KEGG信號通路分析結果(按P值排序的前8位)

2.3 差異表達基因驗證結果 選擇KEGG富集分析中化學致癌通路的Gstt1、Gsta1、Gstm1、Gstm7、Gsta3、Gstp2、Ptgs2、Gsta4、Aldh3b1、Aldh3b2進行差異表達基因驗證，其中Gsta1、Gsta3、Gsta4、Gstm1、Gstm7 、Gstt1、Gstp2屬于谷胱甘肽S-轉移酶(GST)家族。q-PCR法檢測結果與轉錄組測序均顯示，Gsta1、Gsta3、Ptgs2、Gsta4、Aldh3b1、Aldh3b2表達上調，Gstt1、Gstm1、Gstm7、Gstp2表達下調，q-PCR法測得各基因表達變化均與轉錄組測序的趨勢一致(P均<0.05)。見表4。

表4 差異表達基因的mRNA表達水平驗證

3 討論

PM是懸浮在空氣中的固體或液體顆粒的混合物，根據其沉積在肺的部位可分為直徑約10 μm的粗顆粒物(PM10)和PM2.5[5]。研究顯示，PM2.5在可吸入性顆粒物的比重日益增大且組成成分復雜，其中包含的有機成分和無機成分如揮發性有機化合物、多環化合物芳香烴、重金屬、細菌和病毒等都可以對人體造成損害[6-7]。我們課題組前期通過透射電鏡觀察了不同濃度PM2.5處理的MLE-12細胞，發現經PM2.5處理的MLE-12細胞可發生明顯的顆粒物吞噬現象并伴有不同程度的線粒體腫脹、線粒體空泡化、細胞內質網擴張及板層小體損傷，且損傷嚴重程度隨著 PM2.5濃度的升高而升高，提示PM2.5對MLE-12細胞有一定的毒性作用。上皮—間質轉化是惡性腫瘤的特點之一，我們的前期研究檢測了PM2.5暴露后MLE-12細胞中上皮細胞標志物E-cadherin及間質細胞標志物Vimentin的表達，發現PM2.5可促進MLE-12細胞的上皮—間質轉化。WANG等[8]研究發現，在體外暴露于PM2.5中的人非小細胞肺癌細胞A549和人正常肺上皮細胞BEAS-2B中拮抗Notch1信號通路可阻斷上皮—間質轉化及CSC；小鼠體內實驗發現慢性PM2.5暴露能引起顯著的上皮—間質轉化事件和明顯的CSC，提示PM2.5可誘導細胞惡性行為。因此，闡明PM2.5致毒性的機制，明確PM2.5毒性的調控通路，可以為找到PM2.5暴露的早期損傷標志以及制訂PM2.5防治策略提供科學依據。

為了進一步探究PM2.5造成細胞毒性的機制，我們使用轉錄組測序的方法分析PM2.5處理后MLE-12細胞的基因差異表達情況，通過GO和KEGG分析探討其中可能的調控機制。結果顯示，在PM2.5對MLE-12細胞作用24 h后，有1 151個基因出現了差異表達，其中688個基因下調，483個基因上調。GO和KEGG富集分析得到差異表達基因主要集中在調節趨化作用、細胞黏附、谷胱甘肽轉移酶活性等功能和化學致癌性、類固醇生物合成、谷胱甘肽代謝等信號通路上。測序結果顯示，化學致癌通路中GST家族的Gsta1、Gsta3、Gsta4、Gstm1、Gstm7 、Gstt1、Gstp2表達量發生了改變。GST是一個同源二聚體酶的超基因家族，是谷胱甘肽結合反應的關鍵酶[9]。而生物體內的谷胱甘肽防御系統對機體起到十分重要的作用，在生物體受到如除草劑、殺蟲劑、外界化學致癌物質、重金屬等傷害時能與活性物質中的親電子化合物結合，達到抗氧化和解毒的目的[10-11]。GST酶的生物學功能主要是催化內源性或者外來的親電子物質與還原性谷胱甘肽結合，從細胞中消除有毒物質來保護重要的細胞成分如核酸和蛋白質等[12]。環境中的許多化學物質(如多環芳烴類化合物)都是親電子物質，因此GST能代謝掉化學致癌物來保護生物體。據此我們推測，PM2.5中可能存在的某些化合物，使得GST的功能失調而失去解毒作用，進而導致細胞毒性和惡性轉化等。因此深入研究GST基因家族在PM2.5中對機體的作用機制，可能會闡明肺癌的發病因素，為肺癌的防治增加理論基礎。

除測序外，我們用實時熒光q-PCR法驗證了包含GST家族成員的化學致癌通路中差異表達基因的mRNA表達情況，發現與轉錄組測序的趨勢一致，說明了轉錄組測序的準確性。我們在查閱文獻時發現，PM2.5暴露后不同細胞的基因組變化情況有所不同。胡玲娟等[13]用PM2.5處理人正常肺上皮細胞BEAS-2B后進行轉錄組測序，發現IL-17信號通路關鍵基因的表達變化可加重細胞的炎癥反應，促進細胞凋亡。LEI等[14]將PM2.5作用于人肺癌細胞A549并進行轉錄組測序，發現感染性疾病、癌癥、心血管疾病和免疫疾病相關的通路都有所改變。我們課題組使用PM2.5處理小鼠正常肺泡上皮細胞MLE-12，發現化學致癌性以及谷胱甘肽代謝等通路的變化可能是導致細胞毒性以及惡性轉化的原因。

綜上所述，我們將經PM2.5處理后的MLE-12細胞與正常MLE-12細胞進行轉錄組測序，共篩選到1 151個差異表達基因。對差異基因進行GO功能分析，發現差異基因主要參與的生物過程有調節趨化作用、小分子代謝過程、膽固醇代謝過程等；主要細胞成分為細胞外基質、膠原蛋白三聚物、填隙基質等；主要分子功能為鈣離子結合、肝素結合、谷胱甘肽轉移酶活性等。對差異基因進行KEGG信號通路富集分析，發現差異基因富集的信號通路主要為谷胱甘肽代謝、化學致癌性等信號通路。我們發現化學致癌通路中GST家族的Gsta1、Gsta3、Gsta4、Gstm1、Gstm7、Gstt1、Gstp2表達量均發生了改變，因此推測PM2.5導致細胞毒性的機制可能為通過減弱GST的解毒功能而影響化學致癌通路。