基于噬菌體展示技術和新型冠狀病毒的抗體檢測方法構建及驗證

李申，陳漢祎，余卓營，胡克平，王建勛

1 北京中醫藥大學生命科學學院，北京102400；2 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所

噬菌體展示技術是一種通過將外源基因插入至噬菌體特定蛋白的基因中，從而實現在噬菌體表面表達具有活性的外源多肽或蛋白質的技術[1]。噬菌體展示系統主要有絲狀噬菌體、T7噬菌體、λ噬菌體與T4噬菌體等，其中絲狀噬菌體M13的外殼蛋白pⅢ被廣泛應用于展示外源蛋白[2]。M13KO7是M13噬菌體的突變體，含有M13mp1的基因Ⅱ并插入有p15A復制起點及卡那霉素(KANA)抗性基因，通常在以噬菌粒為載體的展示系統中被用作輔助噬菌體[3]。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起，其疫情席卷全球，至今仍在延續。SARS-CoV-2的基因組由29 903個堿基構成，其基因組編碼的結構蛋白中，刺突糖蛋白(S protein)介導了SARS-CoV-2進入細胞，是病毒得以傳播與流行的關鍵蛋白[4]。SARS-CoV-2的入侵通過S protein中S1亞基的SARS-CoV-2受體結合域(RBD)與人類細胞的受體血管緊張素轉化酶2(ACE2)結合[5]。因此，SARS-CoV-2 RBD與ACE2的結合作用是疫苗以及抗體開發所聚焦的熱點[6]。隨著COVID-19疫情蔓延，多個SARS-CoV-2突變株被報道，其中突變株B.1.351在南非肆虐，其RBD的關鍵位點有3個突變(K417N、E484K及N501Y)，E484K和N501Y位于受體結合基序(RBM)中，而RBM正是與ACE2結合的主要功能基序[7]。研究顯示，該突變對恢復期血漿及接種疫苗者血清的中和作用有更強的抗性[8]。2021年7月—9月，本研究通過噬菌體展示技術和SARS-CoV-2構建了一種抗體檢測方法，并觀察了其應用的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料 經RBD免疫后分離的羊駝血清及PHEN1噬菌粒由安第斯抗體生物技術衡水有限公司惠贈；大腸桿菌TG1感受態細胞購自北京博邁德基因技術有限公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞購自北京康為世紀生物科技有限公司；M13KO7輔助噬菌體購自美國NEB公司；SARS-CoV-2 Spike抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司，Human c-myc抗體購自美國R&D Systems公司；Pyrobest DNA聚合酶購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；qPCR 2x SYBR mix購自北京蘭博利德商貿有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；質粒小提試劑盒及EasyGeno快速重組克隆試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；QuikChange Lightning定點突變試劑盒購自美國安捷倫公司；膠回收試劑盒購自德國Qiagen公司；NuPAGE4-12% Bis-Tris蛋白預制膠、NuPAGE SDS running buffer及WB顯色液均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；ELISA包被液購自北京索萊寶科技有限公司；酵母提取物及蛋白胨購自OXDID公司；NaCl購自阿法埃莎(中國)化學有限公司；甘油購自上海麥克林生化科技有限公司；瓊脂糖購自于Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司；瓊脂購自北京華奧正生科技有限公司；SDS-PAGE loading buffer與marker、DNA loading buffer及marker、PEG-8000、PBS速溶顆粒、PBST速溶顆粒、濕轉緩沖液、脫脂奶粉均購自北京蘭博利德商貿有限公司；BSA購自北京拜爾迪生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。NC膜購自北京普利萊基因技術有限公司；高吸附96孔ELISA板購自美國Corning公司；PCR儀、轉膜槽、凝膠成像系統均購自美國伯樂公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Life Technologies公司；SDS-PAGE凝膠電泳槽、山羊抗鼠二抗購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；電泳儀電源及瓊脂糖凝膠電泳槽均購自北京六一生物科技有限公司；數控翹板搖床購自大龍興創實驗儀器(北京)股份公司；恒溫搖床購自上海智城分析儀器制造有限公司；恒溫培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司；恒溫離心機購自德國Eppendorf公司。

1.2 基于噬菌體展示技術和SARS-CoV-2的抗體檢測方法構建

1.2.1 含有SARS-CoV-2 RBD及突變RBD片段的重組噬菌體菌液制備 取大腸桿菌TG1感受態細胞50 μL加至10 mL 2xYT培養基中，37 ℃、250 r/min搖勻培養至光密度(OD)=0.5，加入100 μL M13KO7輔助噬菌體及10 μL質量為50 mg/mL的KANA過夜培養。取過夜培養的菌液，使用質粒小提試劑盒提取MI3KO7輔助噬菌體基因組。以M13KO7輔助噬菌體基因組作為模板，設計引物MI3KO7-1、M13KO7-2，引物序列見表1。PCR擴增MI3KO7-1、M13KO7-2兩條載體片段，擴增條件：95 ℃、3 min變性，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、5 min，共35個循環；72 ℃、10 min延伸。以購自安第斯抗體公司的重組有c-myc標簽及RBD序列的PHEN1-RBD噬菌粒作為模板，使用定點突變試劑盒，構建含E484K、N501Y突變的PHEN1-RBD噬菌粒,引物序列見表1。分別以PHEN1-RBD噬菌粒及含E484K、N501Y突變的PHEN1-RBD噬菌粒作為模板，設計引物，引物序列見表1。PCR擴增含c-myc標簽的RBD及含c-myc標簽且E484K、N501Y突變的RBD目的片段，擴增條件為：95 ℃、3 min變性，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、45 s，共35個循環；72 ℃、10 min延伸。將目的片段與載體的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒，回收大小正確的片段。將兩條載體片段分別與RBD及突變RBD片段使用快速重組試劑盒進行同源重組，獲得PⅢ蛋白信號肽與結構區之間插入外源片段的連接產物，質粒圖譜見圖1。吸取5 μL連接產物加入50 μL大腸桿菌DH5α感受態細胞進行轉化，復蘇后涂布于含50 μg/mL KANA的固體培養基平板上，37 ℃過夜培養后挑取單克隆菌落加入含有50 μg/mL KANA的2xYT培養基中，37 ℃、250 r/min培養12 h，取經培養的菌液使用質粒小提試劑盒提取重組噬菌體基因組，設計引物進行PCR，引物序列見表1。擴增條件：95 ℃、3 min變性，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，共35個循環；72 ℃、10 min延伸。對目的條帶大小符合預期的重組噬菌體基因組進行Sanger法測序，將測序正確的菌液加入200 μL/mL甘油，放置于-80 ℃保存。

表1 基因擴增引物序列

圖1 重組M13KO7噬菌體基因圖譜

1.2.2 重組噬菌體提取 將20 μL測序正確的菌液加入含50 μg/mL KANA的10 mL 2xYT培養基中，37 ℃、250 r/min隔夜培養。將隔夜培養至渾濁的菌液用8 000 r/min、4 ℃離心15 min，小心吸取上清，棄置沉淀。將上清液轉移至新的離心管中，加入PEG/NaCl溶液(146.1 g NaCl、200 g PEG，由超輕水定容至1 L)2 mL，充分顛倒混勻，冰浴1 h。將冰浴后的上清液用10 000 r/min、4 ℃離心30 min，小心棄去上清，并使用1 mL PBS緩沖液重懸沉淀，得到含有RBD片段的重組噬菌體(M13KO7-RBD)及含有突變RBD片段的重組噬菌體(M13KO7-mutant RBD)，將重懸后的噬菌體置于4 ℃保存。

1.2.3 重組噬菌體展示效果驗證 采用Western blotting法。取M13KO7-RBD、M13KO7-mutant RBD各20 μL，加入5 μL SDS-PAGE loading buffer，95 ℃加熱變性裂解15 min，制得樣品。將樣品加樣至預制膠膠孔中，進行SDS-PAGE并濕轉至NC膜。以c-myc抗體為一抗(稀釋比例1∶1 250)，4 ℃孵育過夜；以羊抗鼠多抗為二抗(稀釋比例1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜，顯色，使用成像系統曝光蛋白條帶，與標準蛋白條帶進行對比。

1.3 基于噬菌體展示技術和SARS-CoV-2的抗體檢測方法驗證

1.3.1 重組噬菌體與RBD抗體結合能力觀察 采用qPCR法。取1 μL濃度為1 mg/mL的RBD抗體以包被液稀釋至50 μL，將抗體稀釋液包被至高吸附96孔板中作為實驗組，另取50 μL包被液包被至96孔板中作為對照組，將實驗組與對照組4 ℃包被過夜。次日棄去包被液，使用PBST溶液洗板5次，加入封閉液(含20 mg/mL BSA的PBS-T)300 μL，37 ℃封閉1 h，棄去封閉液，使用PBST溶液洗板5次。實驗組與對照組孔中分別加入50 μL待驗證的M13KO7-RBD、M13KO7-mutant RBD稀釋液(10 μL重組噬菌體加入至40 μL含5 mg/mL BSA的PBS-T溶液中)，37 ℃孵育1 h，棄去重組噬菌體稀釋液，以PBST洗板10次。每孔加入100 μL超輕水，95 ℃加熱洗脫15 min，吸取實驗組與對照組孔中洗脫液作為樣品。設計噬菌體基因擴增引物，引物序列的上游引物5′-GCTTCGTGATTCGTGGCG-3′、下游引物5′-CGGTTTCAGGTTGCTCTT-3′，同時梯度稀釋陽性質粒，繪制標準曲線。進行qPCR反應，采用20 μL反應體系，體系包括10 μL qPCR 2x SYBR mix預混液、上游下游引物各1 μL(10 μmol/L)、樣品1 μL、無酶水7 μL。進行兩步法擴增噬菌體的基因片段，擴增條件為95 ℃、30 s，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40個循環。采集熔解曲線，獲得qPCR擴增曲線并記錄Ct值，根據樣品Ct值通過標準曲線的回歸方程計算其每微升擴增片段的拷貝數。實驗重復3次，取平均值進行分析。

1.3.2 M13KO7-RBD與羊駝血清抗體結合能力觀察 采用qPCR法。取衡水安第斯抗體公司提供的經RBD抗原免疫后采血并分離保存的羊駝血清樣本，將2 μL血清以包被液稀釋至50 μL并封閉，方法同“1.4.2”。取10 μL M13KO7-RBD及10 μL不含重組片段的野生型M13KO7噬菌體，均以含5 mg/mL BSA的PBST溶液稀釋至50 μL，分別以50 μL M13KO7-RBD及野生型噬菌體稀釋液處理封閉后的孔板，洗板、熱裂解后進行qPCR檢測，方法同“1.4.2”。獲得qPCR擴增曲線，記錄Ct值，計算擴增片段的拷貝數。實驗重復3次，取平均值進行分析。

1.3.3 RBD點突變對其與抗體結合能力的影響觀察 采用qPCR法。取RBD抗體稀釋液(1 μL RBD抗體以包被液稀釋至50 μL)包被高吸附96孔板，方法同“1.4.2”。取10 μL M13KO7-RBD和2.5 μL M13KO7-mutant RBD(經熱裂解、qPCR測量其拷貝數后調節至加入拷貝數一致)，均以含5 mg/mL BSA的PBST溶液稀釋至50 μL，將稀釋后的重組噬菌體加入孔中，孵育、洗板、熱裂解、進行qPCR檢測，獲得qPCR擴增曲線并記錄Ct值，計算擴增片段的拷貝數。實驗重復3次，取平均值進行分析。

2 結果

2.1 基于噬菌體展示技術和SARS-CoV-2的抗體檢測方法構建結果 可以檢測到清晰的M13KO7-RBD、M13KO7-mutant RBD條帶，其pⅢ融合蛋白大小略小于75 kDa，與理論大小相符。見OSID碼圖1。

2.2 基于噬菌體展示技術和SARS-CoV-2的抗體檢測方法驗證結果

2.2.1 實驗組、對照組與重組噬菌體結合能力比較 加入M13KO7-RBD的實驗組擴增片段拷貝數為(1.26×106±1.28×105)copies/μL，其對照組擴增片段拷貝數為(3.30×104±5.40×103)copies/μL；加入M13KO7-mutant RBD的實驗組擴增片段拷貝數為(1.01×106±7.58×104)copies/μL，其對照組擴增片段拷貝數為(1.47×105±8.62×103)copies/μL，實驗組擴增片段拷貝數均高于對照組(P均<0.01)。

2.2.2 M13KO7-RBD、無外源片段噬菌體與羊駝血清抗體結合能力比較 加入M13KO7-RBD的羊駝血清擴增片段拷貝數為(1.37×107±1.25×106)copies/μL，加入無外源片段M13KO7噬菌體處理的羊駝血清擴增片段拷貝數為(2.51×106±1.92×105)copies/μL，加入M13KO7-RBD的羊駝血清擴增片段拷貝數高于加入無外源片段M13KO7噬菌體的擴增片段拷貝數(P<0.01)。

2.2.3 M13KO7-RBD、M13KO7-mutant RBD與RBD抗體結合能力比較 加入M13KO7-RBD的RBD抗體擴增片段拷貝數為(2.82×106±1.90×105)copies/μL，加入M13KO7-mutant RBD的RBD抗體擴增片段拷貝數為(8.37×105±2.39×105)copies/μL，加入M13KO7-RBD的RBD抗體擴增片段拷貝數高于加入M13KO7-mutant RBD的擴增片段拷貝數(P<0.01)。

3 討論

噬菌體展示技術可以在缺乏對蛋白結構及序列的了解的情況下，展示不同大小或性質的蛋白質，通過表型篩選獲得其編碼基因。隨著噬菌體展示技術的發展，噬菌體展示已廣泛應用于篩選具有高親和力和強特異性的新型治療性抗體、研究抗原表位、開發多肽類藥物、研究蛋白間相互作用等領域[1,9]。本研究通過改造M13KO7基因組，構建了基于噬菌體展示的抗體檢測方法，并觀察了其在SARS-CoV-2抗體檢測中的應用效果。將制備出的M13KO7-RBD、M13KO7-mutant RBD通過Western blotting法驗證其蛋白展示效果，結果顯示融合蛋白展示RBD及突變RBD片段的效果良好，大小符合預期。進一步使用高吸附ELISA板包被RBD抗體，加入M13KO7-RBD、M13KO7-mutant RBD以結合抗體，使用qPCR擴增噬菌體的基因片段以間接地反映抗體與重組噬菌體的特異性結合，發現與對照組比較，用M13KO7-RBD、M13KO7-mutant RBD處理的實驗組與RBD抗體的結合能力均較好。

相較于抗體篩選中常用的單價展示系統，本方法采用多價展示，理論上可以更多的降低非特異性結合，有助于提高展示水平以放大檢測信號，達成良好檢測效果。HARVE等[11]提出使用噬菌體免疫共沉淀測序技術展示寡核苷酸片段以鑒定血清抗體，該方法采用T7噬菌體展示系統，通過對病原微生物基因組進行生物信息學設計，將其改造為符合噬菌體展示要求的多肽片段并完成展示。通過免疫沉淀聯合高通量測序，可以對患者體內不同表位的抗體譜進行分析，從而在疾病發生機制及交叉免疫等方向提供更為精細化、個性化的數據支持。但由于T7噬菌體所能展示的最大抗原片段僅為30個氨基酸左右，不足以形成與病原微生物相似的蛋白構象，因此該方法僅能對靶向線性表位的抗體實現檢測。STODDARD等[10]的研究使用了T7噬菌體展示系統對SARS-CoV-2進行抗體檢測，發現在19例SARS-CoV-2感染患者血液樣本中均未檢測到任何對RBD片段的免疫應答，這也進一步提示了該方法的局限性。在病毒侵染過程中，靶向RBD等病毒原有構象的抗體往往具有更大的意義和價值，本研究采用M13噬菌體展示系統，pⅢ蛋白可容納長達300個氨基酸的外源片段，且插入片段仍將保留原有的空間結構。本研究在觀察了重組噬菌體與商業化RBD抗體的結合效果后，進一步采用羊駝血清驗證本方法在生物樣品上的應用效果。在SARS-CoV-2 S protein免疫后的羊駝血樣中，相比于對照組，重組噬菌體可以產生5倍以上的富集，提示本研究提供的方法可以對靶向復雜空間表位的抗體進行檢測。隨著疫苗接種的普及，SARS-CoV-2突變帶來的免疫逃逸對疫苗的效力及恢復期血清的中和作用也逐漸引起重視，突變株B.1.351中RBD的突變E484K、N501Y已經多次被報道與免疫逃逸相關[11]。本研究使用M13KO7-mutant RBD檢測突變后抗體與RBD結合能力的變化，發現展示有E484K、N501Y突變的噬菌體相較于野生型RBD的富集效果出現顯著下降，在進一步印證了展示蛋白與SARS-CoV-2的原有結構類似的同時，也說明本方法在研究由病原突變導致的免疫逃逸方面具有潛在價值。

綜上所述，本研究基于噬菌體展示技術，構建了一種適用范圍廣且具有高通量檢測潛力的抗體檢測方法，并觀察了其在SARS-CoV-2中的應用效果。就方法本身而言，相較于高吸附ELISA板，抗體偶聯磁珠、Protein A/G偶聯磁珠亦可用于此方法，理論上可降低非特異性結合，提高靈敏度。除此之外，可利用噬菌體展示技術高通量的特點，構建重組有突變株抗原片段的噬菌體或重組有病毒其他蛋白片段的噬菌體，設計組建重組噬菌體文庫，結合高通量測序技術進行檢測。以上這些都將成為我們日后研究的方向，以期進一步了解病原感染及免疫過程中的相關機制，為疾病的治療提供幫助。