榮筋拈痛方對白細胞介素-1β誘導的體外大鼠軟骨細胞自噬相關基因表達的影響

潘丹虹 李路 王文義 林晴 付長龍 吳廣文 葉錦霞

【摘 要】目的：觀察榮筋拈痛方對白細胞介素-1β（IL-1β）誘導的體外大鼠軟骨細胞自噬相關基因表達的影響，探討其防治膝骨關節炎的作用機制。方法：取4周齡SD大鼠膝關節軟骨，進行軟骨細胞的體外分離培養，選取第2代軟骨細胞甲苯胺藍染色進行細胞鑒定。經IL-1β 10 ng·mL-1誘導建立體外軟骨細胞炎癥模型，誘導成功后，給予榮筋拈痛方（50，100，200 μg·mL-1）孵育48 h。將細胞分為空白對照組，模型對照組，榮筋拈痛方低、中、高劑量組。分別采用CCK-8法檢測榮筋拈痛方對軟骨細胞活性的影響，qPCR法檢測軟骨細胞中LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA表達，Western Blot法觀察自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin 1的蛋白表達水平。結果：與模型對照組比較，榮筋拈痛方低、中、高劑量組均顯著提高細胞活力，呈劑量依賴性增加（P < 0.01）;模型對照組較空白對照組LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表達水平升高（P < 0.05）;經100 μg·mL-1榮筋拈痛方干預后LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表達水平降低（P < 0.05）。結論：榮筋拈痛方可能通過抑制自噬水平，從而具有延緩膝骨關節炎退變的作用。

【關鍵詞】 膝骨關節炎;榮筋拈痛方;軟骨細胞;自噬;白細胞介素-1β;大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rongjin Niantong Fang（榮筋拈痛方）on theexpression of autophagy related gene of interleukin-1β-induced rat chondrocytes in vitro and its mechanism in the prevention and treatment of knee osteoarthritis.Methods：The knee cartilages of 4-week-old SD rats were isolated and cultured in vitro.The second-generation chondrocytes were stained with toluidine blue for cell identification.Via IL-1β 10 ng·mL-1，The chondrocyte inflammation model in vitro was induced.After successful induction，Rongjin Niantong Fang（50，100，200 μg·mL-1）was used for incubation for 48 h.The cells were divided into a blank control group，a model group and the low，medium and high dose groups.The effect of Rongjin Niantong Fang on chondrocyte activity was detected by the CCK-8 method;The mRNA expressions of LC3Ⅱ and Beclin 1 in chondrocytes were detected by qPCR;The ratio of autophagy protein LC3Ⅱ/Ⅰ and the protein expression level of Beclin 1 were observed by Western Blot.Results：Compared with the model control group，the cell viability in the low，medium and high dose groups of Rongjin Niantong Fang significantly increased in a dose-dependent manner（P < 0.01）;The mRNA of LC3Ⅱ and Beclin 1 and the protein expression of LC3Ⅱ/Ⅰ and Beclin 1 in the model control group were higher than those in the blank control group（P < 0.05）;After the intervention of Rongjin Niantong Fang（100 μg·mL-1），the mRNA of LC3Ⅱ and Beclin 1 and the protein expression levels of LC3Ⅱ/Ⅰ and Beclin 1 decreased（P < 0.05）.Conclusion：Rongjin Niantong Fang may delay the degeneration of knee osteoarthritis by inhibiting the level of autophagy.

【Keywords】 knee osteoarthritis;Rongjin Niantong Fang（榮筋拈痛方）;chondrocytes;autophagy;interleukin-1β;rats

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關節軟骨退行性改變和關節炎癥為特征的慢性骨關節疾病[1]，多見于中老年人，年齡≥60歲的人群中約有80%的人出現骨關節炎（osteoarthritis，OA）[2]。自噬是細胞生存、分化和發育必不可少的途徑，在炎癥反應中具有雙向調節作用，在促進和抑制炎癥反應方面同等重要。白細胞介素-1β（IL-1β）被普遍認為是引起關節軟骨基質降解的主要促炎癥細胞因子，常作為OA體外退變軟骨細胞模型誘導劑。前期研究表明，榮筋拈痛方具有多靶點成分，臨床防治KOA效果明顯[3-5]。因此，本研究選用榮筋拈痛方作為干預媒介，以體外退變軟骨細胞作為研究載體，觀察榮筋拈痛方對退變軟骨細胞自噬的影響，為臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選取1月齡SPF級雄性SD大鼠10只，體質量90～100 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2017-0005。

1.2 實驗藥物 榮筋拈痛方由牛膝、當歸、羌活等藥物組成。榮筋拈痛方凍干粉由江陰天江藥業有限公司生產，采用純水回流提取法，常溫浸泡30 min，加熱冷凝回流1.5 h，重復3次提取收集湯藥，在冷凍機低溫干燥24 h制備成榮筋拈痛方凍干粉。其安全性及質量控制均已經完成鑒定，以確保成分均一性、穩定性和有效性，符合用藥標準。

1.3 實驗試劑與儀器 IL-1β（美國Sigma公司，批號MKCL5731）;LC3B、Beclin 1、GAPDH引物由通用生物系統有限公司合成;LC3A/B一抗（美國CST公司，批號4）;Beclin 1一抗（美國Abcam公司，批號GR3254931-2）;GAPDH一抗（美國Abcam公司，批號GR3316865-9）;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa公司，批號AJ11541A）;TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本TaKaRa公司，批號AK31128A）;DMIL/DFC295倒置顯微鏡（德國Leica公司）;ND-2000C超微量核酸分析儀（美國Thermo公司）;CFX96 Touch實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）;逆轉錄儀（德國 Eppendorf公司）。

2 方 法

2.1 軟骨細胞的培養及鑒定 參照課題組前期基礎[6-7]，2只SD大鼠經質量分數為1%的戊巴比妥麻醉后脫頸處死，經體積分數為75%的無水乙醇浸泡5 min，摘取其雙側膝關節純水沖洗后經體積分數為75%的無水乙醇浸泡數分鐘后轉移至超凈工作臺操作：先用PBS漂洗3遍，提取的軟骨碎片置入含質量分數為0.2%的Ⅱ型膠原酶的藍蓋瓶于37 ℃，100 r·min-1水浴搖床消化，每小時吸取1次上清液，120目尼龍網篩過濾，所得濾液置于離心機，離心半徑12.29 cm，以1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，收集軟骨細胞沉淀，重復3次;用含體積分數為10%的胎牛血清的低糖DMEM于37 ℃、體積分數為5%的CO2培養箱進行原代培養，消化培養得到穩定且狀態良好的軟骨細胞，采用甲苯胺藍染色法對第2代軟骨細胞進行鑒定;第2代軟骨細胞爬片長至90%后，棄舊培養液，加入無菌PBS輕柔沖洗3遍;加入1 mL質量分數為4%的多聚甲醛并在室溫下進行固定，30 min后棄固定液，無菌PBS沖洗3遍;棄無菌PBS溶液，每張載玻片加0.2 mL細胞專用甲苯胺藍染色液，室溫孵育30 min，蒸餾水洗凈，室溫晾干，中性樹脂封片后光學顯微鏡下觀察記錄。

2.2 實驗分組與處理 將第2代軟骨細胞懸液以1×105·mL-1的密度接種于6孔板，隨機將細胞分為空白對照組，模型對照組，榮筋拈痛方低、中、高劑量組。空白對照組：質量分數為10%的FBS + 低糖DMEM。模型對照組：質量分數為10%的FBS + 低糖DMEM，經10 ng·mL-1 IL-1β（DMEM完全培養基配制）誘導24 h。榮筋拈痛方低、中、高劑量組：質量分數為10%的FBS + 低糖DMEM，經10 ng·mL-1 IL-1β誘導24 h后，吸棄培養液換成50，100，200 μg·mL-1不同濃度的榮筋拈痛方再干預48 h。

2.3 CCK-8法檢測榮筋拈痛方對軟骨細胞活性的影響 將消化重懸后的軟骨細胞以5×104·mL-1的密度，按每孔100 μL接種于96孔板內貼壁培養24 h;每組設6個復孔，經10 ng·mL-1 IL-1β誘導24 h;棄培養液，換成50，100，200 μg·mL-1不同濃度的榮筋拈痛方再干預48 h;避光條件下每孔加入10 μL CCK-8試劑置于37 ℃培養箱孵育4 h后，用酶標儀震蕩30 s，450 nm讀取OD值。

2.4 q-PCR檢測各組軟骨細胞LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表達 用Trizol法分離提取各組的總RNA，濃度測定后，按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒操作步驟依次進行去除基因組DNA反應、反轉錄反應得到相應組別的cDNA;接著按TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑說明書建立PCR體系，以95℃ 30 s、95℃ 3 s、60℃ 30 s、40個循環、Melt Curve Stage為體系，使用CFX96 Touch實時定量PCR儀進行定量聚合酶鏈反應。使用GAPDH作為內參，反應使用的正向、反向引物序列，見表1。采用?2???Cq方法計算目的基因的相對表達量。

2.5 Western Blot法檢測各組軟骨細胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表達 將各組總蛋白提取后，進行定量、變性。隨后配膠，每孔20 μL上樣后，按20 V 10 min、80 V 30 min、110 V 60 min條件進行電泳;用激活的PVDF膜轉膜后室溫搖床封閉1 h，4?C搖床孵育一抗GAPDH（1∶10000）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1000）、Beclin 1（1∶2000）過夜;TBST蕩洗后室溫搖床孵育二抗1 h，隨后滴加ECL發光液進行顯影操作，最后Image Lab分析條帶進行統計分析。

2.6 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，符合正態分布采用One-way ANOVA方差分析，方差齊組間比較采用LSD法，方差不齊則采用Games-Howell法;不符合正態分布采用Kruskal-Wallis Test非參數檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各代軟骨細胞形態觀察 原代軟骨細胞經質量分數為0.2%的Ⅱ型膠原酶消化，差數貼壁純化培養，倒置顯微鏡鏡下可見：原代軟骨細胞培養1 d時，細胞數量較少，形態不規則，細胞成簇成團貼壁向周圍生長，見圖1（1）。原代軟骨細胞培養8 d時，細胞數量增多，形態為圓形和橢圓形，見圖1（2）。原代細胞經傳代培養為第1代軟骨細胞時，傳代后雜質細胞減少，生長速度加快，貼壁時間縮短，約5 d可以鋪滿皿底，見圖1（3）。第2代軟骨細胞形態較規則，以圓形及橢圓形為主，胞核清晰，胞漿豐富，邊緣清晰，呈典型的“鋪路石”狀，第2代軟骨細胞分裂迅速和第1代軟骨細胞相比又有所提升，約3 d鋪滿皿底，見圖1（4）。因后續傳代培養的第3代[見圖1（5）]、第4代[見圖1（6）]軟骨細胞經傳代部分會分化為肥大細胞，生長速度減慢且細胞形態邊界不清，故選擇細胞生長速度快、形態最佳的第2代軟骨細胞進行后續實驗研究。

3.2 軟骨細胞鑒定結果 選擇第2代軟骨細胞進行甲苯胺藍染色。甲苯胺藍染色后軟骨細胞胞漿呈現深藍色，胞核呈紫色，細胞整體呈藍紫色。見圖2。

3.3 CCK-8法檢測榮筋拈痛方對軟骨細胞活性的影響 與空白對照組比較，模型對照組的細胞活力顯著降低（P < 0.01），而與模型對照組比較，榮筋拈痛方低、中、高劑量組細胞活力均顯著提高，呈劑量依賴性增加（P < 0.01）。見表2。

3.4 各組軟骨細胞LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表達情況 與空白對照組比較，模型對照組LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA表達水平升高（P < 0.05或P < 0.01）;與模型對照組比較，榮筋拈痛方中、高劑量組LC3Ⅱ的mRNA表達水平降低（P < 0.01），榮筋拈痛方低、中、高劑量組Beclin 1的mRNA表達水平降低（P < 0.01）。見表3。

3.5 各組軟骨細胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的蛋白表達比較 與空白對照組比較，模型對照組LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表達水平升高（P < 0.05或P < 0.01）;與模型對照組比較，榮筋拈痛方中、高劑量組LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達水平降低（P < 0.05或P < 0.01），榮筋拈痛方低、中、高劑量組Beclin 1的蛋白表達水平降低（P < 0.05）。見圖3、表4。

4 討 論

KOA屬中醫學“骨痿”“骨痹”或“歷節風”等范疇，《素問·痹論篇》最早提出“骨痹”這一概念，并認為是風寒濕三氣夾雜侵襲人體所致。OA病因病機總屬“本痿標痹”，其本為肝腎虧虛，標為風寒濕邪入侵、瘀血阻滯經絡。故中醫辨證多從風寒濕論治、從肝腎論治及從痰瘀論治[8]，臨床常用方劑有當歸四逆湯[9]、獨活寄生湯[10]、榮筋拈痛方及身痛逐瘀湯[11]等。榮筋拈痛方的補肝腎、壯筋骨、祛風濕和止痹痛功效符合OA痹證日久肝腎兩虛的核心病機，是在國醫大師陳可冀院士指導下擬出的治療OA的新組方。該方由牛膝、當歸、羌活等藥物組成，治療OA的總有效率、疼痛評分以及癥狀積分下降程度與對照組獨活寄生湯比較，差異無統計學意義（P > 0.05），療效相當[12]，該方制備方法和用途已獲國家發明專利授權[ZL201710284659.8]。鄭春松等[3，13]運用計算機模擬探索榮筋拈痛方治療OA作用靶點時發現，其作用靶點有基質金屬蛋白酶-1、IL-1β和腫瘤壞死因子-α，可以通過抑制炎癥、抑制分解代謝和刺激合成代謝等方面保護軟骨，緩解疼痛。林潔等[5]結合BATMAN-TCM預測分析榮筋拈痛方對OA的作用及靶點和動物實驗，初步驗證榮筋拈痛方能夠治療OA。

自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是細胞對各種壓力的反應，細胞器和大分子被吞噬分解參與體內循環以維持細胞代謝穩態，即細胞的“自我吞噬”過程[14]。自噬又是一把“雙刃劍”，可能在軟骨細胞中同時發揮細胞保護和促進死亡的作用[15]。而這可能取決于細胞應激的類型，當在炎癥[16]、缺氧[17]等條件下，可誘導細胞自噬性死亡，自噬也被報道在內質網應激等應激下細胞發揮存活作用[18]。但同時又有研究表明，自噬是有益還是有害取決于炎癥、氧化應激[19]等刺激的程度和持續時間[20]。故保持高水平的自噬可能發揮對軟骨的保護作用;但在某些條件下，過度自噬卻可能造成軟骨細胞的損傷，誘發或加重KOA。

在自噬激活的過程中，Beclin1和LC3是自噬激活的可靠生物標記物，其中Beclin1是酵母自噬基因Atg/Vps30的同源基因，其表達強度與自噬的激活密切相關，Beclin1表達上調是自噬過程激活的必要條件[21]。LC3是Atg8蛋白的一個同源體，也是目前研究最廣泛的一個自噬標記蛋白。LC3蛋白的主要功能是磷脂化，在細胞中有兩種剪切類型，即LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，其中LC3Ⅰ主要定位在細胞質中，LC3Ⅱ則主要定位在自噬小體膜結構上。當自噬形成時，LC3Ⅰ轉變為LC3Ⅱ，并與自噬小泡結合，故LC3Ⅱ數量與自噬形成的程度呈正相關，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率通常用于評估自噬水平[22]。Beclin1表達與自噬體的形成和成熟有關，與自噬水平呈正相關，是自噬的正向調節因子。本研究檢測了大鼠軟骨細胞的自噬相關蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平，結果顯示，在10 ng·mL-1 IL-1β刺激24 h后，模型對照組自噬水平明顯增加;而給予榮筋拈痛方干預后，自噬水平顯著下降。提示IL-1β的炎癥刺激可增加自噬相關蛋白的表達;而榮筋拈痛方可能是通過抑制自噬水平，使自噬恢復動態平衡，從而達到改善軟骨細胞炎癥情況。

綜上所述，100 μg·mL-1榮筋拈痛方對于緩解IL-1β誘導的軟骨細胞過度自噬效果顯著，榮筋拈痛方可以抑制KOA的進展，其機制可能與自噬有關。自噬是一個動態的過程，未來的研究可通過檢測榮筋拈痛方對不同KOA階段軟骨細胞自噬水平的影響，進一步闡明榮筋拈痛方的抗KOA機制，為KOA的防治提供理論依據。

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收稿日期：2021-10-16;修回日期：2021-12-08