基于網絡藥理學和分子對接探討“黃芪-黃連”藥對治療兒童肥胖癥的作用機制

劉 維，張桂菊，閆文月，吳正雪

（1.山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東 濟南 250011）

肥胖癥是熱量攝入長期超過消耗，體內未消耗的熱量以脂肪的形式儲存起來，導致身體脂肪重量超標的代謝性疾病。隨著社會發展和生活方式改變，肥胖和超重的人群逐年增多。《中國居民營養與慢性病狀況報告（2020年）》顯示，我國城鄉居民超重肥胖率持續上升，6～17歲、6歲以下兒童青少年超重肥胖率分別高達19 %和10.4 %[1]。有研究表明[2]，全球近10 %兒童有肥胖癥的困擾。受家庭結構變化的影響[3]，國內肥胖和超重兒童正逐年增加，如不進行干預，兒童肥胖大概率會持續到成年，進一步誘發高血壓、糖尿病、高脂血癥、胰島素抵抗、心功能受損、非酒精性脂肪肝等疾病[4]。研究表明，肥胖癥的產生與全身慢性炎癥反應[5]、糖耐量異常[6]、腸道菌群[7]、脂肪細胞的增生與肥大[8]等因素相關。

中國傳統醫學《黃帝內經》對肥胖進行了論述，“人有肥、有膏、有肉”，“肥貴人則膏梁之疾也”。成人肥胖癥的中醫分型為：（1）胃腑熱盛，（2）脾虛痰濕，（3）脾腎兩虛[9]。通過前期研究[10-12]，我們發現兒童肥胖與成人病因病機有相似性，又與成人有所不同，不可簡單將其視為成人的“縮影”。小兒脾土本不足，加之當下長期高糖高脂飲食的飲食結構，肥甘厚味傷脾，脾主運化功能失常，痰濁膏脂內生，內蘊易化熱。兒童肥胖以胃熱濕阻、脾虛濕盛證型最為常見，脾腎兩虛證所占比例相對較少。

黃芪是豆科植物蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根部，性溫味甘，入肺、脾兩經，可益氣升陽固表、利水行滯通痹；黃連是毛茛科植物黃連的干燥根莖，性寒味苦，入心、脾、胃、肝、膽、大腸經，可清熱燥濕、瀉火解毒[13]。黃芪與黃連配伍，二者溫寒相宜，補瀉兼施，既能益氣健脾，又能燥濕化痰，與肥胖癥虛實夾雜的病機高度契合。本文應用網絡藥理學和分子對接相關技術探討“黃芪-黃連”藥對治療兒童肥胖癥，以期為臨床廣泛使用提供依據。

1 資料與方法

1.1 “黃芪-黃連”活性成分與靶點預測

以“黃芪”“黃連”作為關鍵詞在“中國中藥系統藥理學數據庫與分析平臺”（http://tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）進行搜索，在“Ingredients”界面以口服利用度（oral bioavailability,OB值）≥30 %，類藥性（drug-like，DL值）≥0.18[14]，進行ADME（藥代動力學和藥理學）屬性篩選，篩選出黃芪和黃連的主要活性成分；之后在TCMSP網站的“Related Targets”面篩選出黃芪和黃連的預測靶點。篩選結束后，通過Uniprot蛋白質數據庫最新版（https://www.uniprot.org）對預測靶點進行對照規范，去除非人源基因后，將蛋白質靶點對照為標準基因名稱。

1.2 預測兒童肥胖癥相關基因靶點

通過人類基因數據庫（Gene Cards，https://www.genecards.org）和人類孟德爾遺傳基因數據庫（OMIM，https://omim.org），以“childhood obesity”作為關鍵詞進行搜索，刪除重復值后，篩選出兒童肥胖癥（childhood obedity）的基因靶點。

1.3 藥物與疾病共同靶點篩選及蛋白互作網絡構建

通過R語言編程，篩選出“黃芪-黃連”藥對與兒童肥胖癥的共同靶點；將共同靶點導入STRING平臺[15]（https://string-db.org），限定種屬為人類（Homosapiens），構建出蛋白相互作用網絡（PPI）。

1.4 構建藥物-化合物-作用靶點-疾病作用網絡圖

利用Cytoscape3.7.0軟件（http://www.cytoscape.org），對篩選出的“黃芪-黃連”藥對中的藥物、化合物、靶點以及疾病之間的相互關系構建可視化互作網絡圖。其中藥物、化合物、靶點及疾病用“Node”表示，各節點之間的聯系用“Edge”表示。

1.5 GO基因生物過程與KEGG通路富集分析

對核心靶點基因進行GO基因生物過程富集（gene ontology）[16]、KEGG信號通路富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes）[17]分析，此過程使用Bioconductor生物信息軟件包（http://www.bioconductor.org）處理。并對結果進行可視化處理。

1.6 藥物有效成分和疾病核心靶點分子對接驗證

從TCMSP數據庫下載“黃芪-黃連”藥對中主要活性物質的3D結構，以“.mol2”格式保存。PDB數據庫(https://www.rcsb.org)下載核心靶點蛋白的3D結構，以PDB格式保存。利用PyMol軟件去除核心靶點蛋白的水分子及小分子配體，AutoDock軟件對其加氫，加電荷，對受體和配體進行分子對接，通過結合能的數值評價其結合活性。

2 結果

2.1 “黃芪-黃連”活性成分與靶點結果

在TCMSP數據庫以OB≥30 %，DL≥0.18為篩選條件進行篩選，檢索到“黃芪-黃連”活性成分67個（見表1）。通過TCMSP查詢，得到“黃芪-黃連”藥對的作用靶點共364個。將得到的主要活性成分利用Uniprot數據庫進行篩選，找到各自對應的標準化的基因名，刪除無效和重復靶點后，得到作用靶點109個。

2.2 兒童肥胖癥的疾病靶點

通過OMIM 和Gene Cards分別獲取兒童肥胖癥靶點112個、 6541個，整理后共得到6600個兒童糖尿病靶點。

2.3 “黃芪-黃連”藥對治療兒童肥胖癥共同靶點篩選及互作網絡構建

將藥對主要成分靶點和兒童肥胖癥靶點進行類比分析，共得到藥物與疾病共同作用靶點95個（見表2）。

利用PPI網絡對共同作用靶點進行分析，得到85個節點和350條邊，對其中蛋白質互作頻次最高的30個節點進行統計并繪制圖形（見圖1）。

圖1 蛋白頻次條形圖

由圖1可見，“黃芪-黃連”藥對的中藥成分與絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、表皮生長因子受體（EGFR）、白細胞介素-6（IL6）有較高的生物結合活性，可作為其治療兒童肥胖癥的潛在靶點。

2.4 藥物-化合物-作用靶點-疾病網絡

通過cytoscape3.7.0軟件構建藥物-化合物-作用靶點-疾病調控網絡，共得到135個節點（藥對1個，疾病1個，核心活性成分38個，靶點95個）和415條線（見圖2）。

圖2 藥物-化合物-作用靶點-疾病網絡圖

通過“NetworkAnalyzer”工具進行“度值（degree）”分析，選取度值前5的有效成分作為主要活性成分為：quercetin（槲皮素，drgree：73）、kaempferol（山柰酚，drgree：31）、isorhamnetin（異鼠李素，drgree：15）、7-O-methylisomucronulatol（黃芪異黃烷苷，drgree：15）、formononetin（刺芒柄花素，drgree：11）。

2.5 GO基因生物過程富集分析和KEGG信號通路富集分析

使用GO基因生物過程富集分析，得到106條生物過程， P值從小到大排列，取前20條生物過程可視化（見圖3）。

圖3 GO功能富集分析圖

由圖3可見，protein heterodimerization activity（蛋白質異二聚活性）、DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase II-specific（DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶II特異性）、proximal promoter sequence-specific DNA binding（近端啟動子序列特異性DNA結合）、RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding（RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結合）、chromatin binding（染色質結合）、ubiquitin-like protein ligase binding（泛素樣蛋白連接酶結合）等生物過程中靶點較為集中。

通過KEGG富集分析，一共得到信號通路119條，取P值最小的25條信號通路可視化（見圖4）。

由圖4可見，PI3K/Akt signaling pathway（PI3K/Akt信號通路）、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection（卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染）、human cytomegalovirus infection（人巨細胞病毒感染）、MAPK signaling pathway（MAPK信號通路）等是靶基因主要集中的信號通路。

圖4 KEGG通路分析

2.6 藥對主要活性成分和核心蛋白靶點的分子對接

通過AutoDock1.5.6軟件對藥對主要活性成分核心蛋白靶點分別進行對接，對接結合能見表3。

表3 藥對主要活性成分和核心蛋白靶點對接

其中isorhamnetin（異鼠李素）、formononetin（刺芒柄花素）同絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）的結合能＜-5 kcal/mol。表明異鼠李素（isorhamnetin）和刺芒柄花素（formononetin）與MAPK8具有較好的結合活性[18]。其對接圖見圖5。

圖5 有效成分分子對接圖

3 討論

本文利用網絡藥理學和分子對接，構建了藥物-活性成分-靶點-疾病網絡、有效成分分子對接圖，對“黃芪-黃連”藥對治療兒童肥胖的作用機制進行了預測。在篩選出的67個活性成分中，quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、isorhamnetin（異鼠李素）、7-O-methylisomucronulatol（黃芪異黃烷苷）、formononetin（刺芒柄花素）、hydroxytyrosol（羥基酪醇）、Calycosin（毛蕊異黃酮）等化合物在藥物調控網絡中發揮重要作用。槲皮素可促進巨噬細胞的吞噬功能，影響細胞因子和炎癥介質的分泌，發揮抗炎作用[19]。山柰酚通過抑制IKKβ的活化和IκBα的磷酸化來阻止NF-κB（p65）進入細胞核內，使相關炎癥介質的釋放受影響，抑制肥大細胞炎癥反應；山柰酚還使骨骼肌PI3K/Akt-GLUT信號通路閾值增高，改善兒童肥胖癥的主要并發癥胰島素抵抗，起到降低血糖的作用[20-22]。異鼠李素可通過激活PI3K/Akt信號通路影響葡萄糖代謝，進而改善肥胖[23]。刺芒柄花素可通過調節血脂代謝，減少脂肪沉積[24-25]。羥基酪醇可減少氧化應激反應和抑制NF-κB的機制調節脂肪細胞基因表達譜，進而減少巨噬細胞聚集并改善兒童肥胖癥炎癥[26]。毛蕊異黃酮可通過adiponectin-AMPK-eNO途徑影響周圍血管周圍脂肪組織功能[27]。作為藥物的潛在作用成分，如hederagenin（常春藤苷）、berlambine（氧化小檗堿）等，可作為未來藥理學作用研究的方向。

本次共篩選出95個共同作用靶點，其中有絲裂原激活蛋白激酶-8（MAPK-8）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體（ESR-1）、血管內皮生長因子（VEGFA）、白細胞介素-6（IL-6）等為關鍵靶點。研究表明MAPK-8對關鍵靶點為表皮生長因子受體（EGFR）、有絲裂原激活蛋白激酶-8（MAPK-8）、雌激素受體（ESR-1）細胞的增殖、分化、凋亡等過程有影響，進而抑制脂肪細胞分化[28]。EGFR則可以影響細胞的生長、增殖和分化等生理過程[29]。Khristi等[30]發現缺失ESR-1的小鼠更易肥胖。IL-6作為炎癥反應的主要介質，與內分泌也有密切關系。Margareta等[31]發現人肥大細胞功能異?？僧a生IL-6。有研究表明[32-34]促進新的血管生成有利于健康的脂肪組織擴張，并減少脂肪組織炎癥。PDGF/VEGF生長因子家族在血管生成和內皮細胞生長中發揮著重要作用，可通過ERK、PI3K/Akt通路誘導內皮細胞增殖、促進細胞遷移、抑制凋亡等[35-36]。統上，“黃芪-黃連”藥對可能通過抑制炎癥反應、抵抗細胞凋亡、促進細胞增殖、血管生成等主要途徑發揮作用。

通過GO富集篩選出的“黃芪-黃連”藥對的106生物過程主要以蛋白質異二聚活性、DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶II特異性、近端啟動子序列特異性DNA結合、RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結合、染色質結合、泛素樣蛋白連接酶結合等為主。通過KEGG富集篩選出的119條信號通路中的靶點富集的前幾條通路中，基因數目主要集中在PI3K/Akt signaling pathway、hepatitis B、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、human cytomegalovirus infection、MAPK signaling pathway等信號通路。PI3K/Akt通路與代謝關系密切[37-38]，其廣泛參與和調節合成糖原、脂肪、蛋白質，細胞的存活、增殖和代謝的過程[36]?！包S芪-黃連”藥對的有效成分可通過直接作用于PI3K/Akt通路或通過雌激素受體等靶點激活AMPK和mTORC2，進而激活PI3K/Akt通路調節葡萄糖和脂質的代謝[39-41]，改善兒童肥胖。

分子對接顯示，藥對的主要活性成分同細胞有絲分裂、抑制炎癥有較好的結合活性，表明“黃芪-黃連”藥對通過影響細胞有絲分裂和抑制炎癥反應影響兒童肥胖癥的發展。

本文利用網絡藥理學和分子對接的技術方法，對“黃芪-黃連”藥對治療兒童肥胖癥的可能作用機制進行了闡述，對其潛在的作用成分、作用靶點、關鍵生物學過程、關鍵通路和可能的分子成分進行了論述，為今后中醫藥治療兒童肥胖癥的研究提供思路。