釀酒酵母產脂肪酸乙酯代謝途徑改造

姜 慧，張利華，夏媛媛，陳獻忠

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

釀酒酵母是一種適合微生物大規模長期培養的候選菌，被認為是最具潛力的大規模生產菌種。釀酒酵母具有生長周期短、發酵能力強，容易進行大規模培養等優點，一直是基礎及應用研究的主要對象，在食品、醫藥等領域應用廣泛。釀酒酵母也被用于其他具有重要工業價值代謝產物的發酵，例如乙醇、脂肪酰輔酶A等。通過分子改造阻斷底物葡萄糖的分流從而累積FAEE形成的前體物質乙醇和脂肪酰輔酶A[1-2]，再充分利用WS2的酯化作用[3-4]，有效生成生物柴油的前體物質FAEE，這不僅促進了工業和經濟的發展，對環境的改善作用也不容小覷。

現階段對于通過細胞工廠生產FAEE的研究并不是很多，更多的研究集中在利用化學合成生產FAEE作為柴油的前體物質，不過化學合成高效率的背后卻對環境和原料損耗方面有著極大的負擔，因此從長遠角度考慮，利用細胞工廠生產FAEE更順應時代潮流。目前已嘗試在大腸桿菌E.coli、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae[5-6]、產油酵母Yarrowia lipolytica等微生物體內通過代謝途徑改造生產FAEE，其中在產油酵母Yarrowia lipolytica中通過代謝改造等手段使FAEE產量達到1.18 g/L，是目前報道中最高的[7]。在釀酒酵母中單純通過基因敲除阻斷分支途徑以及異源表達WS2等手段獲得的FAEE最高產量為34 mg/L[8]，本研究FAEE的代謝改造見圖1，FAEE搖瓶產量達到144.4 mg/L，發酵罐產量達到1.35 g/L，此結果在利用釀酒酵母生產FAEE中均處于較高水平。

圖1 代謝改造釀酒酵母產FAEE的策略Fig.1 Metabolic modification of S.cerevisiae for FAEE production

根據生成FAEE過程中前體物質富集以及前體物質酯化將代謝途徑改造分為Module I和Module II兩個模塊，Module I分子改造主要為基因敲除，Module II分子改造主要為基因整合。Module I通過對編碼甾醇?；D移酶的基因ARE1、ARE2敲除來阻斷甾醇酯途徑；對編碼甘油?；D移酶的基因LRO1、DGA1敲除來阻斷三?；视屯緩揭约皩幋a長鏈脂肪酸轉運體的基因PXA2的敲除來阻斷β氧化途徑；Module I中3條途徑阻斷最終富集FAEE前體物質——脂肪酰輔酶A。Module II是在Module I基礎上再異源表達，釀酒酵母密碼子優化的蠟酯合成酶基因WS2將乙醇和Module I中富集的脂肪酰輔酶A在WS2酯化作用下轉化成我們所需的目的產物FAEE[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株，質粒和引物實驗所用菌株見表1，BY4741是釀酒酵母組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和尿嘧啶缺陷型菌株；質粒pMRI-21：由作者所在實驗室保藏，見表2；pMD19-T Simple載體：購自TaKaRa公司；PCR引物：由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成，見表3。

表1 本研究涉及菌株Table 1 Strains involved in this study

表2 本研究所用質粒Table 2 Plasmids used in this study

表3 本研究所用引物Table 3 Primers used in this study

1.1.2 主要培養基

LB培養基（組分g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

YPD培養基（組分g/L）：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。

MM培養基（組分g/L）：YNB 6.7，葡萄糖20，硫酸銨10。

SM培養基（組分g/L）：YNB 6.7，葡萄糖20，硫酸銨10，尿嘧啶0.06。

篩選培養基（組分g/L）：YNB 6.7，葡萄糖20，硫酸銨10，尿嘧啶0.06，5-FOA 1。

發酵培養基（組分g/L）：葡萄糖20，YNB 6.7，酵母粉6，蛋白胨3，K2HPO47.2，KH2PO49.3，醋酸3，尿嘧啶0.06。

BYD5W2發酵罐培養基（組分g/L）：葡萄糖60，YNB 6.7，酵母粉18，蛋白胨3，K2HPO47.2，KH2PO49.3，醋酸3，尿嘧啶0.06。

BYD5W2*發酵罐培養基（組分g/L）：葡萄糖60，YNB 6.7，酵母粉18，蛋 白胨3，K2HPO47.2，KH2PO49.3，醋酸3。

1.1.3 主要試劑與儀器正己烷（色譜級）、乙酸乙酯（色譜級）：阿拉丁試劑公司產品；酵母氮基（YNB）、5-氟乳清酸（5-FOA）：上海生物工程股份有限公司產品；月桂酸乙酯（Ethyl dodecanoate）、肉豆蔻酸乙酯（Ethyl myristate）、棕櫚酸乙酯（Ethyl palmitate）、硬脂酸乙酯（Ethyl Stearate）、二十酸乙酯（Ethyl arachidate）、順-9-十八稀酸乙酯（cis-9-Octadecenoic acid ethyl ester/Ethyl oleate）：Sigma公司產品；十七烷酸乙酯（Ethyl heptadecanoate）、順-9-十六稀酸乙酯（Ethyl cis-9-Hexadecenoate）：TCI公司產品；一步克隆試劑盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit）：南京諾唯贊生物科技有限公司產品；酵母RNA提取試劑盒：Takara生物試劑公司（SYBR Premix Ex Taq ll（Tli RNaseH Plus））產品。

隔水式恒溫培養箱：上海精宏試驗設備有限公司制造；PCR擴增儀：上海東勝興業科學儀器有限公司制造；控溫搖床：太倉市實驗設備廠制造；UV-2100可見分光光度計：上海尤尼科有限公司制造；干燥箱：杭州匯爾儀器設備有限公司制造；高速臺式離心機、ISQ單四級桿氣質聯用儀、超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜聯用儀：賽默飛世爾科技有限公司制造；自動高壓蒸汽滅菌鍋：日本三洋電機公司制造；超凈工作臺：蘇州凈化設備廠制造；電泳凝膠成像系統：BIO-RAD公司制造；實時熒光定量基因擴增儀：美國伯樂公司制造；全自動制冰機：GRANT公司制造；生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所制造；pH計：梅特勒-托利多公司制造。

1.2 方法

1.2.1 敲除盒構建過程對釀酒酵母BY4741基因組進行分析，獲得5個基因，分別為ARE1、ARE2、DGA1、LRO1、PXA2基因，根據基因序列構建敲除盒。以基因ARE1敲除盒構建為例，設計引物ARE1-F和ARE1-R，以釀酒酵母BY4741基因組為模板，PCR擴增ARE1基因，經PCR試劑盒純化后，與pMD19-T Simple載體進行連接，獲得重組質粒Ts-ARE1；以質粒Ts-ARE1為模板，設計引物ReARE1-F和ReARE1-R（分別添加XbaⅠ酶切位點），反向PCR得到片段ARE1U-Ts-ARE1D，凝膠回收該片段，將該片段與質粒Ts-HO-gda-URA3同時經限制性內切酶XbaⅠ消化，凝膠回收后將片段ARE1U-Ts-ARE1D與片段gda393-URA3連接，獲得重組質粒Ts-ARE1-gda393-URA3。以上述重組質粒為模板，用引物ARE1-F和ARE1-R，PCR得到敲除盒ARE1U-gda393-URA3-ARE1D，見圖2。利用相似策略，構建其他基因敲除盒。

圖2 重組質粒TS-ARE1-gda-URA3構建過程Fig.2 Construction process of recombinant plasmid TS-ARE1-gda-URA3

1.2.2 ARE1等基因敲除過程以尿嘧啶缺陷型菌株BY4741為出發菌株，以URA3基因為篩選標記，采用醋酸鋰轉化法[10]將敲除盒依次轉入釀酒酵母BY4741中[14]。敲除盒轉入宿主后涂布到MM固體培養基挑取轉化子，提取基因組，PCR驗證鑒定出正確轉化子；將上述步驟正確的轉化子涂布到5-FOA培養基上，再次挑選轉化子，提取基因組，PCR初步驗證彈出URA3基因后，將PCR產物送至公司測序，序列比對無誤后保藏正確菌株；此方法可以重復利用篩選標記[15-16]。

1.2.3 WS2整合框構建過程對釀酒酵母BY4741基因組進行分析，選取整合位點HO[11]，根據基因序列構建整合框。首先設計引物HO-F和HO-R，以釀酒酵母BY4741基因組為模板，PCR擴增HO基因，經PCR試劑盒純化后，與pMD19-T Simple載體進行連接，獲得重組質粒Ts-HO；以質粒Ts-HO為模板，設計引物ReHO-F和ReHO-R（分別添加XbaⅠ酶切位點），反向PCR得到片段HOU-Ts-HOD，凝膠回收后將片段HOU-Ts-HOD與片段gda393-URA3（兩端具有XbaⅠ酶切位點）連接，獲得重組質粒Ts-HO-gda393-URA3。以PMRI-21質粒為載體骨架，將GAL10啟動子替換成釀酒酵母強啟動子TDH3[12-13]，蠟酯合成酶基因WS2是根據釀酒酵母密碼子優化后的基因，兩端帶有酶切位點Bam H和Xho I，通過酶切連接可以將蠟酯合成酶基因WS2插入質粒PMRI-21的啟動子TDH3和終止子CYC1之間，形成WS2的表達框，質粒命名為pMRI-21-TDH3-WS2-CYC1。用Sma I酶切Ts-HO-gda393-URA3將其線性化，最后通過一步連接將WS2表達框TDH3-WS2-CYC1連接到Ts-HO-gda393-URA3上形成重組質粒Ts-HO-gda393-URA3-TDH3-WS2-CYC1。以上述重組質粒為模板，用引物HO-F和HO-R，PCR得到WS2整合框HO-gda393-URA3-TDH3-WS2-CYC1，具體整合框構建過程見圖3。

圖3 WS2整合框的構建Fig.3 Construction of WS2 integration box

1.2.4 WS2基因整合過程以BYD5為出發菌株，仍以URA3基因為篩選標記，采用醋酸鋰轉化法將整合框轉入出發菌株中[14]。整合框轉入宿主后涂布到MM固體培養基挑取轉化子，提取基因組，PCR驗證鑒定出正確轉化子；將上述步驟正確的轉化子涂布到5-FOA培養基上，再次挑選轉化子，提取基因組，PCR初步驗證彈出URA3基因后，將PCR產物送至公司測序，序列比對無誤后保藏正確菌株；此方法可以重復利用篩選標記[14-15]。

1.2.5 搖瓶發酵優化從-70℃超低溫冰箱中取出甘油管保藏的重組釀酒酵母菌株，挑取菌株于YPD固體平板上劃線活化，置30℃培養箱中培養48 h獲得單菌落。從平板上挑取單菌落接種至10 mL的YPD液體培養基中培養36 h，以體積分數2%接種體積分數接種于50 mL YPD液體培養基中，于30℃、200 r/min搖床中發酵培養60 h[16]。在發酵過程中對是否添加乙醇和菜籽油、發酵時間以及乙醇添加模式這3個因素進行優化。

1.2.6 發酵罐發酵實驗從平板上分別挑取尿嘧啶缺陷菌株BYD5W2的單菌落和尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的單菌落，接種至10 mL的YPD液體培養基中培養36 h，以2%接種體積分數接種于50 mL YPD液體培養基中，培養至OD為2時以10%接種體積分數接種于3 L的發酵罐。發酵過程中待初始葡萄糖低于5 g/L時開始流加80 g/dL葡萄糖以維持發酵罐的糖質量濃度為10 g/L，乙醇從36 h開始保持流加量為8 mL/h，首次添加乙醇時一次性添加體積分數2%菜籽油并通過手動補加5 mol/L NaOH調節發酵罐pH保持在5.5左右。在發酵罐發酵過程中，從12 h開始每4 h取樣檢測OD和葡萄糖質量濃度，從48 h開始每12 h取樣檢測FAEE產量。

1.2.7 產物FAEE的提取取發酵液10 mL，加入終質量濃度5 mg/mL的蝸牛酶振蕩混勻，置37℃培養箱反應12 h進行初步破壁處理，然后再利用超聲波破碎儀在35 W冰上低溫破碎100 min破壁，使細胞徹底釋放出產物。在超聲破碎細胞后立即向細胞液中加入20 mL正己烷，上下顛倒使其充分混勻，在振蕩儀上振蕩15 s后于7 000 r/min離心10 min，分離并收集有機層。重復添加正己烷進行二次萃取，在真空離心濃縮儀中利用正己烷的易揮發性對萃取的FAEE進行濃縮[16]。

1.2.8 GC-MS分析將萃取濃縮后的樣品按比例復溶于正己烷中，過膜后取1 mL進行氣質檢測。氣質分析條件為：DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），進樣器溫度和柱溫均為300℃。升溫程序：起始80℃，維持1 min；然后以2℃/min升溫至100℃；15℃/min升溫至280℃，保持2 min；最后以30℃/min升溫至300℃，保持3 min。質譜：EI離子源，四級桿檢測器；電離能70 eV，離子源表面溫度為280℃[17]。

2 結果與討論

2.1 Module I基因突變株的構建

構建了ARE1、ARE2、DGA1、LRO1和PXA2基因敲除盒質粒，用限制性內切酶Xba I單酶切驗證，條帶大小均與理論一致，測序結果表明ARE1、ARE2、DGA1、LRO1和PXA2基因敲除質粒構建成功。

用上述重組質粒為模板，PCR擴增出相應的敲除盒，通過醋酸鋰轉化法依次轉入宿主中，挑取轉化子，并提取基因組；使用對應同源臂外側上下游引物進行驗證，驗證正確后，將轉化子彈出URA3后再依次用上述引物擴增，擴增條帶大小均與理論一致，最終測序結果表明構建成功，將成功構建的菌株分別命名為BYD1、BYD2、BYD3、BYD4、BYD5。

2.2 Module II蠟酯合成酶WS2基因的表達

HO位點的敲除不影響宿主細胞及其他生理功能，因此在釀酒酵母染色體整合表達操作中，HO位點成為首要選擇。根據PARTOW等人的研究篩選出TDH3、TEF1、PGK1、TPI等啟動子均為釀酒酵母中的強啟動子[12-13]，因此選擇其中較優的TDH3啟動子以及對應終止子CYC1過表達目的基因WS2，以提高表達效率。

構建了WS2基因整合框質粒，用限制性內切酶Nco I單酶切驗證，條帶大小與理論一致，測序結果表明WS2基因整合框質粒構建成功。

用上述重組質粒為模板，PCR擴增出相應的整合框，將其通過醋酸鋰轉化法分別轉入宿主BY4741和BYD5中，挑取轉化子，并提取基因組；使用對應同源臂外側上下游引物進行驗證，理論上應擴增出2 100 bp的條帶，將WS2整合表達在BYD5中且未彈出URA3的菌株命名為BYD5W2*；將轉化子彈出URA3后再依次用上述引物擴增，理論上應擴增出2 100 bp的條帶，PCR結果與預期大小一致，C1為上述未彈出URA3的對照菌株，見圖4。將PCR產物純化并送公司測序，結果顯示構建成功，將成功構建的菌株分別命名為BYW2和BYD5W2。

圖4 WS2轉化BY4741，BYD5彈URA3驗證Fig.4 WS2 transform BY4741 and BYD5 projectile URA3 for verification

蠟酯合成酶基因WS2表達后進行熒光定量PCR驗證，如圖5所示，以ACT1為內參基因，WS2基因表達量為內參基因ACT1的1.42倍，證明WS2已成功表達。

圖5 WS2基因熒光定量PCRFig.5 Fluorescence quantitative PCR of WS2 gene

2.3 FAEE搖瓶發酵優化

FAEE搖瓶發酵過程中，首先對菌株生長情況進行探索，見圖6（a）。原始出發菌株BY4741的菌體濃度OD600最大為20.3，BYW2在出發菌株BY4741的基礎上有些許提升，菌體濃度OD600達到21.7，而目的菌株BYD5W2相較于BY4741與BYW2生長明顯受限，菌體濃度OD600只能達到5.1。由此可見，甾醇酯途徑、三酰基甘油途徑以及β氧化途徑的敲除會阻礙菌株的生長。

從菌株BY4741，BYW2和BYD5W2出發，對FAEE產量進行測定，見圖6（b）。在只補加葡萄糖的發酵條件下，菌株BYD5W2的FAEE產量最高，為11.72 mg/L；FAEE不同碳鏈混標質譜圖見圖6（c），樣品BYD5W2中FAEE檢測質譜圖見圖6（d）。

圖6 重組菌BY4741、BYW2、BYD5W2搖瓶水平的細胞生長和FAEE生產Fig.6 Cell growth and FAEE shake-flask production by precom-binant strains of BY4741，BYW2 and BYD5W2

乙醇作為FAEE生產的兩大前體物質之一，由于其價格低廉且易獲取，通過直接外源添加的方式滿足FAEE生產需求；釀酒酵母可以利用油性碳源，使其成為將廢油等油性物質轉化為有用且廉價的酯化原料的合適宿主。另外，培養基中存在菜籽油等疏水底物，可以觸發細胞外脂肪酶的分泌，將植物油水解成甘油和脂肪酸，為FAEE生產提供充足碳源，從而提升FAEE產量。

因此后期對菌株BYD5W2進行發酵優化，從添加乙醇和菜籽油、發酵時間以及乙醇添加模式3個因素考察。如圖7（a）所示，只補加葡萄糖發酵時，BYD5W2的FAEE產量為11.72 mg/L，在此基礎上補加乙醇，FAEE產量提升到36.1 mg/L，相對于只補加葡萄糖，FAEE產量提升了3.1倍；在此基礎上繼續補加體積分數2%菜籽油，FAEE產量提升到59.3 mg/L，相對于僅補加葡萄糖時FAEE產量提升了5.1倍。結果表明，FAEE發酵過程中補加乙醇和菜籽油會顯著提升FAEE產量。

在搖瓶中添加乙醇和菜籽油，對發酵時間進行優化，分別發酵48、60、72、84、96 h終止發酵，測定FAEE產量。如圖7（b）所示，發酵時間為60 h時FAEE產量最高，為59.3 mg/L。

確定發酵時間為60 h后，對乙醇的添加模式進行探索，由于一次性加入過量乙醇會影響菌體生長[5]，所以采用分批等量的方式以相同間隔時間進行乙醇的添加。如圖7（c）所示，首次補加乙醇時間 取12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56 h，發現在20 h開始補加乙醇，每次補加量為體積分數2%，間隔時間為6 h時，FAEE產量最高，為144.4 mg/L。

圖7 BYD5W2搖瓶發酵優化Fig.7 BYD5W2 shake flask fermentation optimization

2.4 發酵罐發酵檢測FAEE

在搖瓶發酵過程中，BYD5W2生長受到影響，菌體濃度OD600只能達到5.1，這也是限制FAEE產量的重要因素之一，因此采用發酵罐發酵，并對比了尿嘧啶缺陷菌株BYD5W2與尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的FAEE產量的差別，如圖8（a）所示，尿嘧啶缺陷的BYD5W2菌株最大菌體濃度OD600達到24.8，尿嘧啶未缺陷的BYD5W2*菌株最大菌體濃度OD600可以達到35.2；如圖8（b）所示，尿嘧啶缺陷的BYD5W2菌株的FAEE最高產量為0.618 g/L，而尿嘧啶未缺陷的BYD5W2*菌株的FAEE最高產量達到了1.35 g/L。

圖8 5 L發酵罐水平優化FAEE生產Fig.8 Optimization of FAEE production in 5 L bioreator

3 結 語

作者對釀酒酵母代謝途徑進行改造，阻斷甾醇酯途徑、三?；视屯緩胶挺卵趸緩揭詼p少脂肪酰輔酶A的分流，成功構建了不同突變株菌株；利用同源重組在HO位點整合表達了根據釀酒酵母密碼子優化的外源蠟酯合成酶基因WS2，在WS2的酯化作用下乙醇和脂肪酰輔酶A形成FAEE.為了提升FAEE產量，搖瓶發酵階段對是否添加乙醇和菜籽油、發酵時間以及乙醇添加模式這3個方面進行優化，與此同時進行發酵罐發酵進一步提升FAEE產量，獲得以下結論：

阻斷甾醇酯途徑、三?；视屯緩胶挺卵趸緩斤@著提升了FAEE產量，相較于BYW2菌株FAEE產量提升了9倍。以BYD5W2為出發菌株，FAEE發酵過程中補加乙醇和體積分數2%菜籽油會顯著提升FAEE產量，達到59.3 mg/L，相對于只添加葡萄糖發酵的FAEE產量提升了5.1倍；最佳發酵時間為60 h，從20 h開始分批定量補加體積分數2%的乙醇，間隔補加時間為6 h時，FAEE產量最高，達到144.4 mg/L，相對于只添加葡萄糖發酵菌株BYD5W2的FAEE產量提升了12.3倍。發酵罐發酵比較了尿嘧啶缺陷菌株BYD5W2與尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的FAEE產量的差別，結果表明，尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的FAEE產量最高，達到1.35 g/L，是目前報道的釀酒酵母中產FAEE產量較高的水平。