層析填料中頑固色素去除的新方法研究

翁志兵，王鵬紅，趙 力，夏 松，金 堅，朱禎平，李華鐘

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.三生國健藥業（上海）股份有限公司，上海 201210）

隨著抗體藥物的快速上市，相似品種間的競爭日趨激烈。藥監局醫保政策與時俱進，集采步伐日益臨近，抗體藥物的價格呈現斷崖式下跌趨勢，促使抗體藥物為主體的新型療法成為惠及普通病患的治療方法之一[1-4]。但是單克隆抗體的產業鏈發展并不完善，核心技術和關鍵材料大都被歐美企業壟斷，直接導致抗體藥的生產成本居高不下，高昂的生產成本與低廉的銷售價格之間的矛盾凸顯。藥企在降低抗體的生產成本和優化抗體質量的兩方面的需求已成為企業發展的核心[5-11]。基于目前市場及其技術發展的預期，抗體藥物的成本將會從目前每克2 000美元降至每克200美元以下[12]才能惠及更多的患者。

在生物醫藥的各個生產階段，純化成本占整體生產成本的比例高達50%~80%[13]。其中層析介質的成本又在整個純化工段中有著舉足輕重的地位。延長層析介質的使用壽命可以顯著降低生產成本，而在純化生產過程中，層析介質可以有效去除上清液中多種雜質，如宿主蛋白質、內毒素、親和填料脫落的Pro-A、色素等[14-15]。目前蛋白質中間體及原液中的宿主蛋白質、內毒素和殘留的Pro-A蛋白質都有特定的方法精確檢測，吸附在填料中的雜質也可以通過氫氧化鈉、高鹽再生等方式最大限度去除，以免污染最終產品[16]。但是不管是填料還是蛋白質中間體中的色素去除依然是一個重大技術難題。據文獻報道，色素廣泛存在于蛋白質中間體和最終原液中，具體表現為蛋白質中間體和原液呈現不同的顏色，尤其在高濃度蛋白質溶液中尤為顯著[17]，如：鐵離子形成的黃色、黃褐色[18]，維生素B12形成的粉色[19]以及鎳離子形成的藍色，其中以黃褐色最為普遍[20-21]。這些元素主要來自培養基和中間體所接觸到的鐵質工藝設備[22]，如不銹鋼容器及管道；色素污染層析介質的具體表現是含有色素的中間體在層析系統上樣過程中，色素會首先與層析柱上層填料結合，導致層析填料由乳白色變成色素相應的顏色，隨著上樣量和填料循環數的增加，色素會逐步擴散到中下層填料，嚴重時色素等雜質帶來的污染能讓層析柱內的填料塌陷。通常情況下，這些填料吸附的色素會被后續再生工序中的再生液去除，從而恢復填料性能，也避免吸附在填料上的雜質污染下一個工藝循環，將蛋白質原液的雜質殘留降至最低，從而減淡蛋白質中間體的顏色，實現更好的原液質量。但在某些特殊情況下，我們發現用常規的方法無法去除填料中的色素，積累的色素將導致填料的使用壽命降低，具體表現是填料載量明顯下降，填料外觀顏色變深。

作者研究了Capto adhere ImpRes中頑固色素去除的案例，Capto adhere ImpRes是一款將配體N-苯甲基N-甲基乙醇胺耦合到活化的粒徑約40μm的瓊脂糖微球的陰離子交換填料，化學結構示意圖見圖1。

圖1 Capto adhere ImpRes化學結構示意Fig.1 Diagram of chemical structure of Capto adhere ImpRes

抗體蛋白中間體使用Capto adhere ImpRes上樣、平衡、洗脫，蛋白質樣品和Capto adhere ImpRes填料均沒有出現顯著的顏色變化，但純化結束后，用1 mol/L NaOH對該填料進行消毒再生時，發現上層填料的顏色由乳白色變成黃色，且隨著循環次數的增加逐漸加深，最終呈現黃褐色，常規方法處理后填料無法恢復原本的乳白色。基于該類情況，如何開發一種有效去除層析填料色素來延長層析介質的壽命的方法尤為必要。本研究對這類極難去除的色素進行初步的研究，并達到良好的去除效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉，磷酸，氫氧化鈉：國藥控股化學試劑有限公司產品；醋酸，鹽酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉：廣州化學試劑廠產品；Tris：美國Promega公司產品；填料Capto adhere Impres：美國Cytiva公司產品；水：實驗室超純水；所有流動相均經過0.45μm濾膜過濾。

磷酸溶液：分別取0.1、0.3、0.5 mol的濃磷酸于燒杯中，加入超純水攪拌均勻定容至1 L，配制成0.1、0.3、0.5 mol/L磷酸溶液。

平衡液：取1.21 g Tris和8.77 g NaCl置于燒杯中，加入超純水攪拌均勻定容至1 L，經0.45μm濾膜過濾，制成10 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl，常溫保存。

洗脫液：取0.050 mol醋酸置于燒杯中，加入超純水攪拌均勻，定容至1 L，經0.45μm濾膜過濾，制成50 mmol/L醋酸，常溫保存。

再生液：取26.08 g Na2HPO4·2H2O和14.28 g Na2HPO4·12H2O置于燒杯中，加入超純水攪拌均勻，定容至1 L，經0.45μm濾膜過濾，制成200 mmol/L PB，常溫保存。

消毒液：取20 g NaOH置于燒杯中，加入超純水攪拌均勻定容至1 L，經0.45μm濾膜過濾，制成0.50 mol/L NaOH，常溫保存。

保存液：取0.4 g NaOH置于燒杯中，加入超純水攪拌均勻定容至1 L，經0.45μm濾膜過濾，制成0.01 mol/L NaOH常溫保存。

1.2 儀器與設備

AKTA pure m150：美國Cytiva公司產品；pH計、電導儀：瑞士梅特勒-托利多公司產品；NanoDROP 2000型分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司產品；電感耦合等離子體質譜ICPMS 7900：美國Agilent公司產品；電子天平：德國Sartorius公司產品；純水儀：德國Merck公司產品；Centrifuge 5910R冷凍離心機：德國Eppendorf公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 填料孵育方法將不同濃度磷酸溶液分別加入到含有色素的Capto adhere Impres，室溫振蕩處理并分別離心5、10、15 min。處理后的填料經振蕩混勻，用1 mol/L NaOH調pH至中性。

1.3.2 Capto adhere ImpRes的動態載量測試方法將上述處理后的Capto adhere ImpRes按照如下步驟進行處理：首先對柱子進行前處理，依次加入超純水3 cv（cv代表柱體積，3 cv即3個柱體積），消毒液3 cv，超純水3 cv，再生液3 cv，超純水3 cv，平衡液3 cv；然后進行上樣；最后對柱子進行后處理，依次加入平衡液6 cv，洗脫液5 cv，消毒液3 cv，超純水3 cv，保存液3 cv。各溶液配方見表1。

表1 不同溶液的配方Table 1 Formulations of different solutions

1.3.3 鐵離子測量方法利用電感耦合等離子體質譜法（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）分析檢測蛋白質樣品中的Fe離子的濃度，將0.2 mL樣品溶液準確地轉移到15 mL離心管中，用2 g/dL硝酸溶液稀釋至2 mL，充分混合并于12 000 r/min離心10 min，取上清液進行檢測。ICPMS法檢測的儀器參數設定為：RF射頻功率1 550 W，蠕動泵轉速0.1 r/s，采樣速度0.3 r/s，樣品采樣時間為60 s，穩定時間40 s，采樣深度8 mm，輔助氣體（高純氬氣）流量1.0 L/min，載氣（高純氬氣）流量為1.14 L/min。

2 結果與分析

2.1 不同種類濃度酸溶液處理結果

分別使用17.5 mol/L醋酸、14.63 mol/L磷酸、1 mol/L檸檬酸和12 mol/L鹽酸加入到含有色素的Capto adhere Impres中，室溫振蕩處理5 min，觀察填料顏色變化。由圖2可知，濃磷酸去除填料色素的能力高于檸檬酸，上清液呈黃色；濃醋酸和濃鹽酸不能明顯去除填料色素，因此后續實驗選用磷酸去除填料色素。

圖2 不同濃度酸處理后的Capto adhere ImpresFig.2 Capto adhere Impres after treatment with different concentrated acids

2.2 不同濃度磷酸溶液孵育結果

使用不同濃度的磷酸溶液加入含有色素的Capto adhere Impres里，室溫振蕩5、10、15 min，取上清液離心，測鐵離子質量濃度，孵育后的填料用1 mol/L NaOH調pH至中性，沉降分層。由表2可知，0.5 mol/L磷酸處理填料5 min時，上清液中鐵離子濃度最高，去除色素能力最強。色素去除后對各組填料載量性能進行測試，0.5 mol/L磷酸處理時間為10~15 min后的載量恢復到填料初始狀態（載量約76 mg/mL）。

由表2和圖3可知，相同磷酸濃度下，孵育最初10 min，載量隨時間增長快速增加，10 min后增長變緩，而鐵離子質量濃度卻逐漸降低，推斷在磷酸處理填料過程中，鐵離子可能與填料基架的多孔結構發生二次吸附，因而鐵離子質量濃度隨時間呈下降趨勢。二次吸附的鐵離子預計在下次NaOH消毒處理填料時再次產生色素，因此需要控制孵育時間；在相同孵育時間的條件下，隨著磷酸濃度的增加，鐵離子質量濃度和載量同時增加。綜上所述，磷酸濃度和孵育時間對去除填料色素及恢復載量有重要影響。

表2 不同濃度磷酸處理不同時間的Capto adhere ImpresTable 2 Capto adhere Impres treated with different concentrations of phosphoric acid for different time

圖3 不同濃度磷酸處理不同時間的Capto adhere ImpressFig.3 Capto adhere Impress treated with different concentrations of phosphoric acid for different time

使用不同濃度磷酸和不同的孵育時間對Capto adhere Impress進行響應面分析，將表2數據導入到JMP軟件中，以磷酸濃度和孵育時間為輸入值，鐵離子質量濃度和載量為響應輸出，進而得到圖4。由圖4可知，藍色線為75 mg/mL載量等高線，紅色線為20μg/mL鐵離子質量濃度等高線，白色區為推薦工藝操作面。填料對照組載量為75.86 mg/mL，以76 mg/mL載量為實驗目標，選擇0.5 mol/L磷酸孵育填料8.75~11.35 min就可以實現以上目的。

圖4 響應面分析法Fig.4 Response Surface Methodology

3 結 語

在本研究的陰離子填料案例中，在蛋白質上樣、平衡、洗脫階段，中間體樣品和填料均沒有出現顯著的顏色變化，但在NaOH對填料進行消毒再生時，填料由乳白色逐漸變黃色，且隨填料的循環次數增加，顏色逐漸加深，最終呈黃褐色，推測填料中吸附的鐵離子與氫氧化鈉發生反應，產生黃色沉淀顆粒，并沉積滯留于填料多孔腔內部，反應如下：

隨著酸的加入，Fe（OH）3沉淀逐步溶解，釋放鐵離子到酸溶液中，酸溶液顏色逐漸變黃。當鐵離子到達一定質量濃度后，鐵離子又與填料發生可逆吸附，使得溶液中的鐵離子逐漸減少。可以預見，后期對填料再次進行NaOH消毒處理后，色素會繼續產生。在填料色素去除能力方面，磷酸和檸檬酸效果大于鹽酸和醋酸，推斷是由于三價酸和鐵離子結合力大于一價和二價酸，磷酸效果大于檸檬酸，推斷強酸更利于結合鐵離子，具體原因還有待進一步研究。作者通過對不同濃度磷酸處理不同時間的Capto adhere Impress中的色素研究，發現磷酸可以顯著去除Capto adhere Impress的色素，并恢復填料壽命到最佳狀態，同時最大程度降低填料中的雜質對蛋白質中間體影響，對使用相關填料的工業化生產降本增效產生積極影響。