枯草芽孢桿菌普魯蘭酶基因的分泌表達及其在粉絲制作中的應用

祝冬君，張錦雯，姚 雁，單逸藍，楊夢蓮，沈 微*，3，楊海泉，夏媛媛，陳 磊，陳獻忠

（1．江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2．無錫先秦生物科技有限公司，江蘇 無錫 214073；3．江南大學 中國高校工業微生物資源數據平臺，江蘇 無錫 214122）

普魯蘭酶是一類淀粉脫支酶，主要用于淀粉制糖工業中，與其他淀粉水解酶協同作用以提高淀粉水解效率，減少極限糊精殘留，提高葡萄糖得率和產品質量[1-2]。近年來，相關研究者還開發了以普魯蘭酶為催化劑的新工藝和新產品，例如以淀粉為原料的直鏈淀粉、抗性淀粉生產工藝[3-4]。本課題組在前期工作中建立了一種酶法粉絲制作工藝，在粉絲制作的制芡糊階段用普魯蘭酶處理芡糊，通過催化淀粉脫支反應，提高芡糊中直鏈淀粉的含量，從而使制作出的粉絲與明礬粉絲質量一致[5]。進一步研究發現，在酶法粉絲制作中，與耐酸性普魯蘭酶相比，中性普魯蘭酶具有更高的催化效率，所制作的粉絲成品的質量也明顯優于以酸性普魯蘭酶為催化劑獲得的粉絲[6-7]。由于普魯蘭酶主要是在淀粉制糖工業的糖化階段與糖化酶聯合使用，因此市售普魯蘭酶均為酸性普魯蘭酶，尚缺乏針對粉絲制作工藝開發的中性普魯蘭酶產品，且目前普魯蘭酶的市場價格較高，因此開發高活性、食品安全的中性普魯蘭酶對酶法粉絲工藝的應用具有關鍵性的意義。芽孢桿菌及其近緣微生物是中性普魯蘭酶的重要來源[8-12]，其中，芽孢桿菌屬、厭氧芽孢桿菌屬、地芽孢桿菌屬的一些種的普魯蘭酶基因已經被克隆表達[11-14]。這些普魯蘭酶在耐熱性等方面差異顯著，但其最適pH均在中性或接近中性，只有厭氧芽孢桿菌某些種的普魯蘭酶最適pH可以達到5.5左右，但在pH為6.5時仍具有較高的活性。可見，芽孢桿菌及其近緣微生物是篩選粉絲制作專用普魯蘭酶的理想宿主菌。枯草芽孢桿菌是公認食品安全的微生物，是淀粉酶、蛋白酶等多種食品級酶制劑的生產菌。如果能夠以枯草芽孢桿菌為宿主菌，高效表達其自身的普魯蘭酶，這將有利于解決中性普魯蘭酶的來源及食品安全問題。Malle等[12]從枯草芽孢桿菌中克隆并在大腸桿菌中異源表達了一種I型普魯蘭酶，當時的研究發現這是一種胞內普魯蘭酶。本研究發現，枯草芽孢桿菌普魯蘭酶在適當的條件下可以少量分泌到大腸桿菌細胞外，在枯草芽孢桿菌中可以實現高效分泌表達，實際上是一種胞外酶，而且這種酶的分泌表達產物的酶學性質與胞內產物存在顯著差異。作者研究了枯草芽孢桿菌普魯蘭酶基因的表達、重組酶性質及其在粉絲制作中的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）模式株168、淀粉酶基因缺陷株1A717[6]：均為中國高校工業微生物資源信息平臺提供，保藏號分別為CICIM B0030和CICIM B0021；大腸桿菌（Escherichia coli）表達載體pLac03、pUP43：均為作者所在課題組前期構建[6，13]，含有上述質粒的大腸桿菌轉化子的保藏號分別為CICIM B6937和CICIM B6941；表達耐熱型中性普魯蘭酶GsP的重組大腸桿菌JM109/pLac03-GsP[13]、重組枯草芽孢桿菌1A717/pUP43-GsP[6]：均為作者所在課題組前期構建，菌株保藏號分別為CICIM B6922和CICIM B6924。

1.1.2 工具酶及主要試劑限制性核酸內切酶Mlu I、Kpn I、Spe I、Sal I、蛋白質電泳標準相對分子質量（Prestained Protein Ladder）：賽默飛世爾科技有限公司產品；連接酶、DNA聚合酶Ex Taq、核酸電泳標準相對分子質量DL10000：寶生物工程（大連）有限公司產品；普魯蘭糖：MegaZyme公司產品，購自上海意果科技有限公司；其他試劑：均購自國藥集團。

1.1.3 引物在NCBI公布的枯草芽孢桿菌模式株168菌株的基因組序列（美國國家生物技術信息中心登錄號：NC_000964.3）中有一段標注為amyX的基因，根據Malle等[12]研究其產物為普魯蘭酶，作者將其命名為BsP基因，根據其序列設計引物如下：

引物Plb1、Plb2、Pbs1、Pbs2中帶下劃線部分分別為內切酶Mlu I、Kpn I、Spe I、Sal I識別位點，帶雙下劃線部分為核糖體結合位點。引物Plb1、Pbs1與普魯蘭酶基因編碼區5′端一致，引物Plb2、Pbs2與普魯蘭酶基因編碼區3′端互補。下游引物中帶波浪線部分為6個組氨酸編碼序列，用于重組酶的純化。

1.1.4 培養基大腸桿菌和枯草芽孢桿菌培養種子液均采用LB培養基，搖瓶發酵培養均采用TB培養基，均按常規方法配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 普魯蘭酶重組表達載體的構建提取B.subtilis 168菌株的基因組，以基因組為模板，以Plb1、Plb2為引物進行PCR擴增，用Mlu I和Kpn I酶切目的基因片段和表達載體pLac03，連接之后轉化E.coli JM109，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取轉化子進行液體培養，提取轉化子質粒進行酶切驗證和測序。

以B.subtilis 168的基因組為模板，以Pbs1、Pbs2為引物進行PCR擴增，用Spe I和Sal I酶切目的基因片段和表達載體pUP43，連接后轉化E.coli JM109，涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取轉化子進行液體培養，提取轉化子質粒進行酶切驗證和測序。

1.2.2 普魯蘭酶重組枯草芽孢桿菌的構建將表達載體pUP43-BsP轉化到B.subtilis 1A717中，轉化方法見文獻[15]，涂布在含卡那霉素的LB平板上，挑取轉化子提取質粒，酶切驗證。其中枯草芽孢桿菌質粒提取方法見文獻[16]。

1.2.3 重組普魯蘭酶的表達及產物的分析重組菌株E.coli JM109/pLac03-BsP和對照菌株E.coli JM109/pLac03的種子液及搖瓶發酵的培養方法同文獻[13]，發酵結束后，收集發酵液提取胞外、周質和胞質粗酶液，進行酶活檢測。基本操作過程如下：取適量發酵液，4 000 r/min離心10 min，收集離心后的上清液作為胞外粗酶液。將離心后的菌體重懸于含有20 g/dL蔗糖的磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖液中，冰浴2 h后離心去上清液，再將菌體重懸于與發酵液等體積的磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖液的低滲透壓的溶液中，由于滲透壓的急劇變化，周質中的蛋白質被釋放到環境中，4 000 r/min離心10 min，上清液即為周質粗酶液。沉淀部分再次重懸于磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖液中，超聲波破碎細胞，離心取上清液為胞質粗酶液。酶活檢測、SDS-PAGE凝膠電泳分析重組酶的分布情況，普魯蘭酶酶活測定方法同文獻[12]。其中，酶與底物的反應溫度一般為45℃。酶活定義為：在相應條件下，每分鐘分解普魯蘭糖所釋放的還原糖，其還原力相當于1μmol葡萄糖所需的酶量，用1 U表示。

重組菌B.subtilis 1A717/pUP43-BsP及對照菌B.subtilis 1A717/pUP43的種子液及搖瓶發酵的培養方法同文獻[6]，發酵結束后，收集發酵液提取胞外和胞質粗酶液，并進行酶活檢測和SDS-PAGE凝膠電泳分析。胞外和胞質粗酶液的提取方法同上。

1.2.4 重組普魯蘭酶的純化重組酶的C端帶有His-tag標簽，所以采用鎳柱進行親和層析純化，具體純化方法如下：取胞外粗酶液5 mL，經0.22μm濾膜過濾，用含有0.5 mol/L NaCl和0.02 mol/L咪唑的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液（濃度為0.02 mol/L，pH 7.4）作為上樣緩沖液，用含0.5 mol/L咪唑和0.5 mol/L NaCl的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液作為洗脫液，梯度洗脫，流量為1 mL/min。SDSPAGE蛋白質電泳分析純化結果，測定蛋白質含量，計算比酶活。純化柱為His-Trap HP 1 mL親和層析柱，GE公司產品，購自國藥集團。

1.2.5 重組普魯蘭酶酶學性質的測定重組酶最適溫度的測定：分別在30、35、40、45、50、55、60、65℃下測定酶活的大小，以最高酶活為100%，計算相對酶活。重組酶最適pH的測定：在pH為4.0~8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，測定酶活力，以最高酶活為100%，計算相對酶活。重組酶熱穩定性的測定：將酶液置于40、45、50、55℃金屬浴中處理3 h，分別測定處理0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后的酶活，以未處理的酶活為100%，計算相對酶活。金屬離子對重組酶酶活的影響測定：以10 mmol/L的不同金屬離子溶液替換酶活力測定反應體系中的緩沖液，用鹽酸或氫氧化鈉調節金屬離子緩沖液pH為6.0，以去離子水代替金屬離子溶液作為對照，以對照酶活為100%，計算相對酶活。每個數據均做3個平行樣。

1.2.6 重組普魯蘭酶動力學參數的測定配制質量濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL的普魯蘭多糖，取不同濃度的底物在最適溫度及pH條件下與普魯蘭酶BsP反應，以蒸餾水代替酶液作為空白對照，DNS法測定生成的還原糖含量，計算不同底物質量濃度[S]（mg/mL）時的酶促反應初速度V（μmol/（mL·min）），作V-[S]曲線圖，用L-B雙倒數作圖法計算出酶的Km值和Vmax。

1.2.7 重組普魯蘭酶水解普魯蘭多糖的產物分析麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖的標準品質量濃度10 g/L，取過量重組普魯蘭酶與普魯蘭糖在最適條件下反應，對照為滅活酶液與普魯蘭糖反應，對標準樣和酶反應產物樣品進行HPLC檢測。色譜條件：Bio-Rad HPLC Organic Acid Analysis Column Aminex HPX-87H Ion Exclusion Column 300 mm×7.8 mm，以5 mmol/L H2SO4為流動相，流速設置為0.5 mL/min，柱溫設置為55℃。

1.2.8 重組酶在粉絲制作中的應用按傳統方法制作粉絲，在文獻[7]的基礎上根據枯草芽孢桿菌表達的重組普魯蘭酶的性質稍做改變，主要涉及第一步制芡糊，具體如下：取淀粉或紅薯粉100 g，用100 mL溫水懸浮，一次性加入700 mL沸水，并劇烈攪拌成芡糊，冷卻至45℃時加入普魯蘭酶攪拌混勻，在45℃水浴鍋中保溫30 min。后續步驟包括和面、制絲、煮絲、理絲、晾干均與文獻[7]相同。明礬粉絲制作方法同文獻[7]，以普魯蘭酶GsP和PUL3665為催化劑的粉絲制作方法分別與文獻[6]和文獻[7]一致。粉絲斷條率、膨潤度和煮沸損失率的計算方法均同文獻[7]，檢測時均做2組平行實驗。

2 結果與分析

2.1 重組菌的構建

以枯草芽孢桿菌168的染色體DNA為模板，以Plb1和Plb2為引物進行PCR擴增，獲得2.2 kb的擴增產物，產物大小與根據枯草芽孢桿菌普魯蘭酶基因BsP大小一致。用核酸內切酶Mlu I和Kpn I酶切目的片段和表達載體pLac03，連接后轉化E.coli JM109，任取4個轉化子提取質粒，酶切驗證。結果表明，這4個轉化子所含質粒用Mlu I和Kpn I酶切后獲得2.6 kb和2.2 kb的兩個片段，分別與pLac03空質粒和擴增片段一致。圖1（a）是其中1#轉化子質粒酶切電泳圖，酶切圖譜符合重組質粒應有的特點（圖1（b））。進一步測序顯示，4個重組質粒中插入片段的序列完全相同，與枯草芽孢桿菌BsP基因編碼區完全一致，編碼區的3′端增加了由引物帶入的6個組氨酸密碼子，用于表達產物的親和層析純化，包括6個組氨酸密碼子的編碼區全長2 175 bp，編碼的多肽鏈理論相對分子質量為81 800。重組菌誘導表達后進行細胞破碎，破碎液檢測到明顯的普魯蘭酶活性，而含空質粒的對照菌則細胞內外均未檢測到酶活。這個結果與Malle等[12]對amyX基因的研究結果一致，說明克隆的基因編碼的蛋白質是一種普魯蘭酶，將上述1#轉化子命名為E.coli JM109/pLac03-BsP，簡寫為JM109/pLac03-BsP，用于后續實驗。

圖1 重組質粒pLac03-BsP酶切驗證圖和物理圖譜Fig.1 Restriction analysis and map of the recombinant plasmid pLac03-BsP

2.2 重組普魯蘭酶的分泌表達及純化

在本課題組的前期工作中曾對嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）的普魯蘭酶基因GsP和地表地芽孢桿菌（G.subterraneus）的普魯蘭酶基因pul3665進行研究，結果顯示這兩種基因在大腸桿菌中的表達產物均有相當大的部分可以分泌到周質空間和細胞外[7，13]。序列比對顯示，BsP基因編碼的蛋白質BsP與地芽孢桿菌來源的兩種耐熱型普魯蘭酶GsP和PUL3665的氨基酸序列的同源性大概為50%。為了研究BsP在大腸桿菌中分泌表達的可能性，將重組菌分別在LB培養基和TB培養基中進行培養和誘導表達。結果顯示，重組菌JM109/pLac03-BsP在LB中誘導表達后細胞外培養液中檢測不到明顯的酶活，細胞破碎液則有較高的普魯蘭酶酶活，折合到等體積發酵液其酶活大約為46 U/mL。重組菌JM109/pLac03-BsP在TB培養基中誘導表達后細胞外培養液中的普魯蘭酶酶活大約為0.6 U/mL，雖然活力不高但很明顯，而含空質粒的對照菌在同樣條件下則完全檢測不到酶活。肖亞朋等[13]研究發現，表達GsP基因的重組大腸桿菌只有在TB培養基中誘導表達時普魯蘭酶才能分泌到細胞外，而在LB培養基中誘導表達時培養液中檢測不到酶活。本研究結果與其一致，但GsP分泌表達量相比本研究的BsP明顯更高，前者培養液酶活達到2.3 U/mL。

為研究基因BsP表達產物在大腸桿菌中的分泌情況，將重組大腸桿菌JM109/pLac03-BsP和JM109/pLac03-GsP誘導表達后分離細胞各組分分析重組酶及重組蛋白質的情況，結果見圖2~3。

圖2的1~3泳道為重組菌胞質內蛋白質的電泳結果，對比這3個泳道可知，相對于含空質粒的對照菌，重組菌JM109/pLac03-BsP和JM109/pLac03-GsP的胞內蛋白質在相對分子質量80 000左右均有一個明顯的表達條帶，分別與BsP基因和GsP基因對應蛋白質的理論相對分子質量81 800和81 300一致。從表達條帶的濃度看，BsP基因的表達量明顯比GsP更高，酶活檢測結果顯示，JM109/pLac03-BsP胞質組分的酶活為44.7 U/mL，而JM109/pLac03-GsP胞質組分的酶活為29.6 U/mL，這個結果與蛋白質條帶的差異能大致對應，從這個結果看BsP、GsP兩條基因的表達產物的比酶活應該比較接近。

圖2 重組菌株胞質蛋白質SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of cytoplasmic protein of the recombinants

圖3的1~3泳道是重組菌周質蛋白質的電泳結果，對比3個電泳道可見，與對照菌相比，重組菌JM109/pLac03-BsP和JM109/pLac03-GsP的周質蛋白質在80 000附近也存在明顯的差異表達條帶，與各自的重組普魯蘭酶相對分子質量一致。從差異表達條帶的濃度看，GsP的條帶很濃，而BsP只有很微弱的差異條帶，用軟件Image Lab 4.0對兩個條帶進行分析顯示，條帶所代表的GsP的濃度是BsP的12倍。進一步進行酶活檢測，結果顯示JM109/pLac03-GsP的周質酶活為14.6 U/mL，而JM109/pLac03-BsP的周質酶活為4.6 U/mL。顯然，兩者酶活的差異顯著小于蛋白質濃度的差異，初步推算可以發現，周質中BsP的比酶活大約是GsP的4倍，這和胞質內重組酶比酶活的計算結果形成明顯的矛盾。由于周質中BsP的含量過低，未能獲得其純酶，同時考慮到大腸桿菌周質蛋白質的分離并不準確，容易被胞質內組分污染，因此在大腸桿菌中只采用胞質內蛋白質進行重組BsP的分離純化。圖2泳道4是純酶的電泳結果，可見采用鎳柱親和層析得到的產物顯示為單一條帶，結合蛋白質質量濃度檢測進行計算，大腸桿菌胞質內BsP純酶比活力為27.7 U/mg，這與Malle等[12]獲得的BsP純酶比酶活24.1 U/mg比較接近。

圖3 重組菌株周質蛋白質SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis ofperiplasmic protein of the recombinants

2.3 重組枯草芽孢桿菌的構建

以B.subtilis 168的基因組為模板，以Pbs1和Pbs2為引物進行PCR擴增得到目的基因，將目的基因和載體pUP43用Spe I和Sal I酶切連接，并轉化大腸桿菌，挑取轉化子提取質粒酶切驗證。圖4（a）中泳道1是其中1#轉化子所含質粒的酶切電泳圖，用Spe I和Sal I酶切后電泳顯示大小為2.2 kb和6.7 kb的兩條帶，與BsP基因和表達載體pUP43的大小一致（圖4（b））。進一步測序顯示，重組質粒中的插入片段與amyX基因編碼區一致，編碼區的3′端增加了由引物帶入的6個組氨酸密碼子。

圖4 重組質粒pUP43-BsP酶切驗證圖和物理圖譜Fig.4 Restriction analysis and map of the recombinant plasmid pUP43-BsP

將重組質粒pUP43-BsP轉化到B.subtilis 1A717中，提取轉化子質粒進行酶切驗證，結果顯示所提取質粒的酶切圖譜與圖4（a）一致，表明該菌株是轉入了重組質粒pUP43-BsP的重組菌，將該重組菌命名為B.subtilis 1A717/pUP43-BsP，簡稱1A717/pUP43-BsP，用于后續實驗。

2.4 BsP基因在枯草芽孢桿菌中的表達

按上述方法進行重組枯草芽孢桿菌重組酶的發酵。重組枯草芽孢桿菌1A717/pUP43-BsP和1A717/pUP43-GsP發酵至36 h，發酵上清液酶活分別達到71 U/mL，和34 U/mL。圖5是重組菌發酵上清液的SDS-PAGE電泳圖。對比圖5的1~3泳道可知，相對于對照菌株，1A717/pUP43-BsP和1A717/pUP43-GsP的發酵液上清液在81 000附近有明顯表達條帶，與目的蛋白質理論相對分子質量一致。由圖5泳道2、3可見，GsP基因的表達量明顯高于BsP基因，但酶活檢測顯示，發酵液中GsP的酶活不到BsP的一半，顯然BsP的比酶活遠高于GsP，這與大腸桿菌周質酶活檢測及蛋白質電泳分析結果一致。對1A717/pUP43-BsP發酵上清液進行純化，圖5泳道4為純化后的酶液，顯示為單一條帶。測定其蛋白質濃度，經過計算得出該蛋白質的比酶活為153.7 U/mg，這個比活力是同一基因在大腸桿菌胞質內表達產物的5.5倍。結合大腸桿菌中BsP胞質內產物和周質產物的差異可見，BsP的周質分泌表達產物的比活力遠高于胞質內非分泌產物的比活力。鑒于BsP基因在枯草芽孢桿菌中分泌表達產物和在大腸桿菌胞質內產物的比活力顯著差異，在后續工作中前者命名為BsBsP，后者為EcBsP。

圖5 重組菌株胞外蛋白質SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of extracellular protein of the recombinants

BsBsP和EcBsP是同一個基因的表達產物，兩種蛋白質的酶學性質發生大的差異一般可能有兩個原因，一是蛋白質折疊方式不同，二是蛋白質的后加工。對于后一種情況，由于枯草芽孢桿菌不是真核生物，不存在糖基化等后修飾現象，最有可能發生的是蛋白質的部分切除。由于兩種蛋白質的純酶都是利用其羧基端的組氨酸殘基通過親和層析分離的，因此羧基端一定是完整的。為驗證兩種蛋白質氨基端是否有差異，將純化得到的BsBsP和EcBsP送上海生工生物技術公司進行氨基端測序。測序結果表明,BsBsP和EcBsP氨基端的6個氨基酸一樣，都是Met-Val-Ser-Ile-Arg-Arg，與BsP基因編碼區的5′端翻譯產物完全一致，可見2種蛋白質的N端均未發生部分切除，因此2種蛋白質的氨基酸序列應該完全相同，EcBsP比酶活低的原因很可能源于形成立體結構過程中發生的錯誤折疊。

2.5 重組普魯蘭酶的酶學性質

2.5.1 重組普魯蘭酶的最適溫度和最適pH在pH 6.0的緩沖液中，30~65℃溫度范圍內測定BsBsP的相對酶活，結果見圖6。BsBsP在40~50℃時酶活較高，45℃為最適溫度，溫度超過50℃時酶活迅速下降。EcBsP的最適pH、最適溫度和溫度穩定性檢測結果與BsBsP幾乎完全相同，以下不再贅述。

圖6 溫度對重組普魯蘭酶BsBsP酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on the activity of the recombinant pullulanase BsBsP

在45℃下，測定不同pH值的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液對酶活力的影響，結果見圖7。重組普魯蘭酶BsBsP對pH變化較敏感，pH為5.5~6.5時，酶活均在最高酶活的90%以上，6.0為最適pH值。pH 5時相對酶活為47%，pH超過6.5時酶活力下降明顯。

圖7 pH對重組普魯蘭酶BsBsP酶活力的影響Fig.7 Effects of pH on the activity of the recombinant pullulanase BsBsP

2.5.2 重組普魯蘭酶的熱穩定性將酶液置于40、45、50、55℃金屬浴中處理3 h，每間隔0.5 h測定相對酶活，結果見圖8。40℃保溫處理3 h，相對酶活在80%以上；45℃保溫處理3 h，相對酶活在60%以上；溫度超過45℃，酶活下降迅速；50℃保溫處理3 h，相對酶活僅為19%；在55℃下BsBsP迅速失活。

圖8 重組普魯蘭酶BsBsP的熱穩定性Fig.8 Thermo-stability of the recombinant pullulanase BsBsP

2.5.3 不同金屬離子及溶液對重組普魯蘭酶酶活力的影響在45℃、pH 6.0條件下，測定幾種常見金屬離子及溶液對普魯蘭酶BsBsP和EcBsP的催化活力的影響，結果見表1。Mn2+、Co2+對兩種酶的活性均有激活作用；Na+、K+、Fe2+、Cu2+對兩種酶的活性有一定的抑制作用；Zn2+對重組酶均有強烈抑制作用，在實驗條件下兩種重組酶的酶活幾乎完全喪失。Na+對BsP活性的作用是一個需要重視的問題，因為粉絲制作的芡糊中需要添加1 g/dL的氯化鈉。進一步實驗顯示，增加Na+對BsP的影響不明顯，另外酶活檢測是在磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖液中進行，由于溶液本身含有鈉離子，因此雖然鈉離子對酶活有影響，但對其在粉絲中應用的影響可能并不大。從表1可知，金屬離子及化合物對BsBsP和EcBsP的影響基本一致，只有SDS的影響相差很大，SDS導致BsBsP酶活幾乎減少一半，而對EcBsP幾乎沒有影響。

表1 不同金屬離子及試劑對BsP酶活力的影響Table 1 Effects of different metal ions and reagents on the enzyme activity of BsP

2.5.4 重組普魯蘭酶的動力學參數按照1.2.6的方法測定BsBsP的酶促反應動力學參數，做出重組酶BsBsP催化普魯蘭多糖的V-[S]曲線圖，見圖9。根據L-B雙倒數曲線圖（圖10），得到線性方程y=2.863 6x+1.301，由此可得重組酶BsBsP的Km=2.201 mg/mL，Vmax=0.769μmol/（mL·min）。

圖9 BsBsP作用于普魯蘭多糖的V-[S]動力學曲線Fig.9 V-[S]kinetic curve of BsBsP acting onpullulan

圖10 Linewaver-Burk雙倒數曲線圖Fig.10 Linewaver-Burk double reciprocal curve

2.6 重組普魯蘭酶對普魯蘭多糖的降解

取過量BsBsP與普魯蘭多糖在45℃反應2 h，對降解產物進行HPLC檢測，結果見圖11。BsBsP降解底物普魯蘭多糖生成單一產物麥芽三糖，沒有檢測到麥芽糖、葡萄糖以及潘糖，表明BsBsP只作用于普魯蘭多糖的α-1，6-糖苷鍵，對α-1，4-糖苷鍵不起作用。將BsBsP與質量濃度為0.5 g/dL的直鏈淀粉溶液在45℃反應24 h，結果顯示BsBsP對直鏈淀粉溶液藍值沒有影響，進一步表明BsBsP不降解α-1，4-糖苷鍵，由此可見BsBsP是一種專一性降解α-1，6-糖苷鍵的I型普魯蘭酶。在粉絲制作中，采用I型普魯蘭酶處理芡糊可以獲得質量較高的成品粉絲，而II型普魯蘭酶由于具有水解α-1，4-糖苷鍵的活性，導致淀粉鏈變短，由此獲得的粉絲斷條率較高[17]。BsBsP完全不水解α-1，4-糖苷鍵，比較適合在粉絲制作中使用。

圖11 BsBsP催化普魯蘭多糖降解的產物分析Fig.11 Analysis of BsBsP-catalyzed degradation products of pullulan

2.7 重組普魯蘭酶BsBsP在粉絲制作中的應用效果

將重組枯草芽孢桿菌1A717/pUP43-BsP發酵獲得的普魯蘭酶發酵液用超濾機進行超濾濃縮，獲得最終酶活681 U/mL的濃縮酶液，將BsBsP濃縮酶液用于馬鈴薯淀粉粉絲的制作，結果見表2。

表2 添加BsBsP對馬鈴薯淀粉粉絲質量的影響Table 2 Effects of BsBsP addition on the quality of potato starch vermicelli

表2結果表明，按照傳統粉絲的制作工藝，如果不添加明礬，制作出的粉絲在煮絲階段互相粘連嚴重，質量不合格。如果用適量BsBsP處理芡糊可以解決煮絲階段的并條問題，也可以制作出質量合格的粉絲。按照本文方法制作粉絲，按每克芡糊淀粉1 U的量添加BsBsP處理芡糊，制作的粉絲斷條率可以控制在10%以內，基本達到優質粉絲質量的國家標準，但以這一條件制作粉絲時粉絲并條較多，這可能增加后續理絲階段的工作量，因此酶的使用效果不夠理想；如果按照1.5 U的量使用普魯蘭酶，則粉絲并條現象基本消失，所制作的粉絲的斷條率大約為2.5%，與添加明礬獲得的粉絲非常接近；繼續增加酶的用量對進一步提高粉絲質量沒有明顯的作用，因此每克芡糊淀粉1.5 U普魯蘭酶是比較合適的用量。這個結果與采用GsP處理芡糊的效果基本一致[6]，所獲得的粉絲的質量也很接近。

紅薯粉是粉絲制作的另一種重要的原材料，由于部分保留了紅薯香甜的口感及更多的營養成分而受到人們的歡迎。由于紅薯粉是一種未經提純的初級農產品，成分復雜，因此以紅薯粉為原料制作粉絲時有一定的困難[7]。表3是BsBsP用于紅薯粉粉絲制作的實驗結果。

由表3可知，以紅薯粉為原料制作的粉絲斷條率明顯比采用純淀粉為原料制作的粉絲的斷條率高。采用BsBsP水解芡糊可以解決煮絲階段并條問題，也能在一定程度上降低產品斷條率，但斷條率只能降低到10%左右，而且酶的用量需要達到3 U，增加酶的用量并不能進一步提高粉絲的質量。本課題組前期開發的兩種耐熱型中性普魯蘭酶GsP和PUL3665用于紅薯粉粉絲制作時，成品粉絲的斷條率可以降低到5%左右[7]，但與純淀粉粉絲的質量仍有差距。BsBsP用于以紅薯粉為原料的粉絲制作時其工藝條件還需要進一步改進。在所試驗的方法中，用紅薯淀粉替代大約50%的紅薯粉可以明顯改進粉絲質量，在使用1.5 U的BsBsP的條件下，所獲得的成品粉絲斷條率一般可以降低到7%~9%，基本達到優質粉絲的質量標準，但由此獲得的粉絲的風味明顯不如純紅薯粉粉絲。另外由于紅薯粉種類繁多且質量差距很大，BsBsP用于紅薯粉絲制作的效果很不穩定，因此其使用方法還需要進行更詳細的探索。從產品質量考慮，BsBsP目前只適合于淀粉為原料的粉絲制作。

表3 添加BsBsP對紅薯粉絲質量的影響Table 3 Effects of BsBsP addition on the quality of sweet potato vermicelli

3 討論

作者研究了枯草芽孢桿菌普魯蘭酶基因BsP的表達，結果表明在枯草芽孢桿菌中BsP可以高效分泌到胞外，在大腸桿菌中則可以少量分泌到胞外。本研究采用的表達載體pLac03和pUP43本身均不含信號肽編碼區，因此重組蛋白質的分泌表達是依靠自身結構完成的。用信號肽分析軟件TatP（https：//services.healthtech.dtu.dk/）對BsP基因編碼的蛋白質序列進行分析顯示，蛋白質的N端可能存在雙精氨酸（twin-arginnine translocation，Tat）信號肽，其中第5、6位的連續兩個精氨酸是其核心區。對BsP基因表達在大腸桿菌胞質內的重組蛋白質EcBsP和表達在枯草芽孢桿菌細胞外的蛋白質BsBsP進行N端測序顯示，兩種蛋白質的N端序列一致且均與按照BsP基因序列推測的蛋白質序列完全一致。Sec途徑和Tat途徑是細菌最重要的蛋白質分泌途徑。其中，通過Sec途徑分泌的蛋白質在分泌過程中其N端的一段信號肽會被切除，而通過Tat途徑分泌的蛋白質由于采用先折疊后分泌的方式穿過細胞膜，一般不存在N端信號肽切除的現象[18]。N端測序和軟件分析均顯示，基因BsP的表達產物通過Tat途徑分泌到細胞外。作者所在課題組前期對枯草芽孢桿菌的近緣微生物嗜熱脂肪地芽孢桿菌（G.stearothermophilus）和地表地芽孢桿菌（G.subterraneus）的普魯蘭酶基因GsP和pul3665研究發現，兩者在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中均能依靠自身結構實現分泌表達。其中，GsP蛋白質的N端測序顯示，其胞外蛋白質的N端未發生信號肽切除的現象，因此推測其分泌表達是通過Tat途徑實現的，但用TatP等信號肽預測軟件對這個蛋白質的N端進行分析時卻并未發現有Tat或其他形式的信號肽。圖12是上述3種普魯蘭酶N端部分氨基酸序列的比對結果，3種蛋白質的序列具有一定的同源性。對3種蛋白質分子全域序列進行比對顯示，BsP與另外兩種蛋白質的同源性在50%左右，而3種分子均為I型普魯蘭酶，推測三者在各自細胞中應具有相同或相似的功能。從圖12還可以看出，在3種蛋白質中只有BsP有典型的雙精氨酸結構（—R—R—），其他兩種蛋白質都只有第6位有一個精氨酸，其中GsP的精氨酸殘基左右兩側甚至都不是堿性氨基酸。人們對大腸桿菌研究發現，雙精氨酸（—R—R—）結構是雙精氨酸途徑信號肽的核心，這個特征幾乎一成不變[19-20]。但本研究及文獻[13]的結果顯示，GsP基因在大腸桿菌中表達產物分泌到胞外的量顯然超過BsP。朱新文等報道的基因pul3665在大腸桿菌中分泌表達的量也顯然超過本文大腸桿菌胞外BsP的量。由此可見，在非大腸桿菌來源的蛋白質中，雙精氨酸（—R—R—）序列可能不一定是Tat信號肽的必須結構，判斷一種蛋白質是否能通過Tat途徑實現分泌表達不能過于依賴這一特征。

圖12 3種普魯蘭酶N端序列比對Fig.12 Sequence alignment of N terminal of three pullulanases

作者還發現，BsP基因在大腸桿菌中的表達產物能否分泌到細胞外還和培養條件有關。采用TB培養基培養的細胞表達的重組酶可以少量分泌到細胞外，而采用LB培養基培養的細胞在誘導表達后培養液中未檢測到明顯的普魯蘭酶酶活。有關GsP的研究也發現了類似的情況。枯草芽孢桿菌及其近緣微生物已經有多個普魯蘭酶基因被克隆并實現了異源表達，如嗜熱喜油地芽孢桿菌（G.thermoleovorans）[11]、熱鏈型地芽孢桿菌（G.thermocatenulatus）[21]等。作者所在課題組早年研究了蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）和地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）的普魯蘭酶基因BlP和BtP在大腸桿菌中的表達[22-23]，這些研究均以LB培養基培養細胞，均未發現重組酶利用自身結構分泌到細胞外的現象。從本研究結果看，如果采用本研究的條件對上述基因重新進行研究有可能獲得不同的結果。

BsP基因在胞質內和細胞外的表達產物表現出不同的性質。BsP基因在大腸桿菌胞質中的表達產物EcBsP和在枯草芽孢桿菌胞外表達產物BsBsP的氨基酸序列一致，但前者比酶活為27.7 U/mL，而后者為153.7 U/mg，后者為前者的5.5倍。枯草芽孢桿菌是一種公認食品安全的微生物，而胞外產物的提取可以省去細胞破碎的過程，因此更有利于技術的實際應用，因此枯草芽孢桿菌更適合于BsP基因的表達。從蛋白質電泳的情況看，BsBsP在枯草芽孢桿菌中的表達量還不夠理想，明顯小于另一種普魯蘭酶GsP的表達量，這導致發酵液中BsBsP的酶活相比GsP沒有表現出應有的優勢。BsP表達量不夠高的一個重要原因可能是其基因中含有較多的細菌稀有密碼子。在細菌密碼子中，精氨酸的密碼子AGA和AGG是對基因表達水平影響較大的稀有密碼子。在BsP基因中，AGA和AGG密碼子合計共有15個，占全部精氨酸密碼子的41.7%，而GsP蛋白質雖然有52個精氨酸殘基，但GsP基因卻完全沒有上述兩種密碼子。從密碼子情況看，通過密碼子、表達條件等的優化，BsBsP蛋白質的發酵水平還有很大的提升空間。

4 結語

枯草芽孢桿菌魯蘭酶基因BsP表達產物利用雙精氨酸途徑可以實現高效分泌表達。分泌表達產物BsBsP具有較高的比酶活，在以淀粉為原料的粉絲制作中有一定的應用前景。