人參皂苷Rg1對疲勞小鼠骨骼肌中TFAM和NRF-1基因表達的影響

孔凡秀，楊 琪，董佳萍，謝琳琳，王鶴霖，遲曉星

（黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319）

人參皂苷Rg1是一種重要的人參皂苷單體，目前在多領域都有對人參皂苷單體的功能性研究[1-4]，但在其抗疲勞作用方面的研究相對較少[5]。疲勞的產生伴隨著能量的大量消耗，其中包括血糖與肌/肝糖原的消耗，同時伴隨著疲勞產物的積累，機體調節協同機能失調等。

線粒體作為人體主要的產能場所，大量運動后機體內氧化磷酸化形成超氧化物等活性氧簇，這些活性氧簇的產生使線粒體機能衰退，導致膜活性下降，影響了線粒體電子的傳遞和氧化磷酸化的進行，導致ATP合成不足，造成機體運動能力下降，誘發運動性疲勞的發生。線粒體的功能結構與骨骼肌的功能密切相關[6]，線粒體轉錄因子A（TFAM）為線粒體DNA的上游調節基因[7-8]，TFAM能夠與線粒體DNA相結合，形成一種類核復合體結構，此結構能夠保護線粒體DNA（mtDNA）免受活性氧簇的損傷。作為一種由細胞核基因編碼的線粒體蛋白質，除可參與線粒體的轉錄、復制及形成擬核結構等生物合成方面的功能外，還可以保護線粒體免受氧化損傷。核呼吸因子-1（NRF-1）參與多種核編碼基因和TFAM等的表達[9]。NRF-1和TFAM等組成的信號通路在線粒體生物合成中起著重要的調節作用，參與mtDNA的轉錄和復制[10]。

作者通過強制小鼠力竭游泳造成小鼠疲勞運動模型，觀察不同劑量人參皂苷Rg1對骨骼肌中抗氧化指標以及與線粒體生物合成密切相關的轉錄因子TFAM和NRF-1基因表達的調節作用，以期發現人參皂苷Rg1的抗疲勞作用及可能的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑人參皂苷Rg1（純度98%）：南京斯道夫生物科技有限公司產品；環磷酰胺：江蘇盛迪醫藥有限公司產品；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、肝/肌糖原、蛋白質定量試劑盒：南京建成生物工程研究所產品。

1.1.2 主要儀器5424高速離心機：美國Eppendorf公司產品；紫外可見分光光度計：上海INESA公司產品；酶標儀：BioTec公司產品；恒溫培養箱：DRP-9162上海森信公司產品；ABI-7300 Real-time檢測儀：ABI公司產品。

1.2 動物與分組

雄性BALB/c小鼠70只，2月齡，體質量18~21 g，遼寧長生生物技術有限公司提供。小鼠按體質量隨機分7組，每組10只，灌胃給藥前，除空白靜止和空白運動組外，其他組小鼠注射環磷酰胺制作免疫抑制模型。

人參皂苷Rg1用生理鹽水溶解，Rg1低（L）、中（M）、高（H）劑量組的灌胃劑量分別為12.5、25、50 mg/kg[11]；空白靜止組（BSG）、空白運動組（BEG）和模型組（MG）按體質量以等量生理鹽水灌胃，陽性對照組（P）生理鹽水溶解貞芪扶正顆粒，連續灌胃21 d。小鼠在溫度為（20±2）℃、相對濕度為40%～60%、光/暗循環12 h環境下飼養。

1.3 小鼠免疫疲勞模型的建立

免疫低下和疲勞密不可分，免疫低下個體更易形成疲勞模型。將健康小鼠隨機分組后，除BSG與BEG組腹腔注射生理鹽水外，其余組腹腔注射環磷酰胺造模，根據文獻[13-14]確定環磷酰胺劑量為30 mg/kg，連續7 d可造成小鼠免疫低下模型。每周兩次進行無負重游泳訓練，如出現直立性游泳、眼鼻滲血等不能順利完成游泳者被淘汰。各實驗組小鼠置于水中互不接觸，不停驅趕使之不停游泳，游泳結束后盡快擦干小鼠皮毛。訓練時間為20 min，周期為21 d。

1.4 小鼠負重力竭游泳實驗

疲勞模型建立之后，除空白靜止組外，小鼠進行負重游泳試驗，末次灌胃半小時后，將小鼠尾巴根部綁緊其自身體質量5%的鉛皮，放入水深35 cm、水溫為（25±1）℃的游泳箱中，用秒表記錄時間，沉沒后10 s仍不能浮出水面，該時間為小鼠的力竭游泳時間[15-17]。

1.5 指標測定

1.5.1 疲勞和抗氧化生化指標測定小鼠處死后取肝臟、骨骼肌等組織，生理鹽水漂洗后濾紙吸干，按試劑盒說明測定丙二醛（TBA法）、乳酸脫氫酶（微量酶標法）、肌/肝糖原（比色法）等生化指標。

1.5.2 小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表達水平測定取骨骼肌組織，提取總RNA，RT-PCR測定小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表達水平。

1）基因序列

管家基因引物序列：

目的基因引物序列：

2）骨骼肌RNA提取和鑒定 取小鼠骨骼肌100 mg，加TRIZOL提取RNA。通過變性瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，并在紫外分光光度計測定RNA的質量濃度及純度。

3）逆轉錄反應 取3μg RNA，以oligo（dT）為引物進行反轉錄，進行cDNA合成。20μL體系中含有5×RT緩沖液4μL，2.5 mmol/L dNTP混合液4μL，1μL RNA酶抑制劑，MMLV反轉錄酶1 μL，3.5μmol/L oligo（dT）引物1μL，RNA 3 pg，反應條件：37℃1 h，然后95℃保持5 min，冰上放置5 min，備用。

4）熒光定量PCR反應 樣品按以下反應體系進行：10×PCR緩沖液2.5μ，MgCl2溶液3 pL，dNTP混合液3 pL，Taq聚合酶3 U，0.25 X Sybergreen，上游引物F（20 pmol/L）0.5 pL，下游引物R（20μmol/L）0.5 pL，cDNA 1μL，加ddH2O至總體積為25μL。反應條件為：95℃反應20 s，60℃反應20 s，72℃反應20 s，87℃反應10 s，共40個循環。反應結束后，電腦自動分析熒光信號并將其轉換為Ct值。結合RNA濃度，將熒光定量PCR定量結果進行換算，得出待測樣本的RNA表達量。

5）PCR產物定量分析的校正 采用Beta-actin作為內參照。將TFAM、NRF-1和內參基因Ct值之間的差值來計算基因表達差異。

1.6 數據處理

數據采用SPSS 20.0進行單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較，數據均以均值±標準差（x±s）表示，以組間方差分析P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠負重游泳的力竭時間

從表1可以看出，與空白組相比，各劑量組小鼠負重游泳的力竭時間均有不同程度的延長，尤以中劑量組效果最為明顯。與空白組和模型組相比，中劑量（25 mg/kg）的人參皂苷Rg1可顯著延長小鼠的力竭游泳時間，增長率為271.4%，差異有顯著性（P<0.01）。

表1 小鼠負重游泳力竭時間Table 1 Exhausted time of mice swimming with load

2.2 小鼠肝臟和骨骼肌中糖原水平

如圖1所示，各組間肌糖原濃度無顯著差異性。與模型組比較，中劑量人參皂苷Rg1組可明顯增加小鼠肝糖原濃度（P<0.05），說明在中劑量時人參皂苷Rg1增加疲勞小鼠肝糖原的效果較好。

圖1 人參皂苷Rg1對小鼠肝糖原和肌糖原濃度的影響Fig.1 Effects of ginsenoside Rg1 on glycogen levels of liver and skeletal muscle of mice

2.3 小鼠骨骼肌中MDA、LDH的水平

如圖2所示，與MG組比較，人參皂苷Rg1各劑量組小鼠骨骼肌中MDA質量摩爾濃度均明顯下降，差異具有顯著性（P<0.01）。與空白靜止組相比，模型組、空白運動組和低劑量組骨骼肌中LDH活性下降明顯（P<0.01）；與模型組和空白組相比，中、高劑量組小鼠骨骼肌中LDH活性增加顯著（P<0.01）。

圖2 人參皂苷Rg1對小鼠骨骼肌中MDA和LDH的影響Fig.2 Effects of ginsenoside Rg1 on MDA and LDH content in skeletal muscle of mice

2.4 小鼠骨骼肌中TFAM和NRF-1基因表達水平

從圖3可以看出，與模型組相比，中劑量人參皂苷Rg1可顯著增加小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表達水平，說明人參皂苷Rg1在25 mg/kg的劑量下，對骨骼肌中線粒體相關因子的調節作用最好，從而提高線粒體的生物合成，使線粒體氧化供能增強。

3 結 語

目前已有研究發現，人參皂苷Rg1主要是通過加速自由基清除率、增強體內抗氧化物酶活性、維持血糖水平、促進糖原合成等方面共同協作發揮抗疲勞作用。疲勞的產生通常伴隨著能量的大量消耗，其中包括血糖與肌/肝糖原的消耗，同時伴隨著疲勞產物的積累，機體調節協同機能失調等[18]。本研究結果顯示，中劑量的人參皂苷Rg1顯著增加了小鼠肝糖原濃度，可有效減少能量消耗。有學者通過實驗證實，小鼠灌胃人參提取物后可延長力竭負重游泳時間，具有抗疲勞作用。宋姌和劉濤[19]研究發現，人參皂苷Rg1可明顯降低慢性疲勞綜合征大鼠脂質過氧化物丙二醛的含量，同時增強抗氧化酶SOD的活性，說明人參皂苷Rg1能夠提高抗氧化酶系統活性并減輕脂質過氧化代謝產物的堆積，具有良好的抗疲勞作用。王瑩等研究表明，人參皂苷Rg1能顯著延長小鼠力竭游泳時間，降低血清中尿素氮水平，同時維持血糖水平，增加肌糖原和肝糖原儲備，顯著降低小鼠運動后血乳酸濃度，以上研究結果與本實驗結果基本一致。在本實驗中，小鼠游泳運動后與正常運動組小鼠比較，肝和骨骼肌中MDA質量摩爾濃度并無顯著性差異。在給予人參皂苷后，各劑量組的人參皂苷對骨骼肌組織中的MDA質量摩爾濃度均有降低作用。

圖3小鼠骨骼肌中TFAM mRNA和NRF-1 mRNA表達水平Fig.3 Expression of TFAM mRNA and NRF-1 mRNA in skeletal muscle of mice

TFAM基因的啟動子上具有多種調節因子的識別位點，其中NRF-1占主導位置，二者與DNA結合后可增高其mRNA的表達及升高TFAM的蛋白質合成，從而增加線粒體進行生物合成[9]。NFR-1的主要作用是調控mtDNA的表達，包括線粒體轉錄因子A（TFAM），其中TFAM在調控mtDNA表達及線粒體基因組復制中起重要作用。TFAM是mt DNA復制轉錄的直接調控子[21]，學者通過敲除了TFAM基因的大鼠發現，mtDNA的復制明顯減少，并且線粒體電子傳遞能力受到損傷[22]。線粒體功能的改善可能與TFAM的大量表達相關聯，其作用還有參與調節線粒體的轉錄機制[20]。NRF-1能調控多種線粒體蛋白質的表達[12]。TFAM可在NRF-1的作用調節下激活，對mtDNA的復制與轉錄起著重要的調控作用。趙婷婷等研究證實，一次長時間大鼠游泳后能促進骨骼肌中PGC-1α與TFAM mRNA的共同表達，黃芪丹參復合物可通過p38MAPK-PGC-1α-NRF-1-TFAM途徑促進線粒體生物發生。實驗結果顯示：不同劑量的人參皂苷Rg1可同時上調NRF-1和TFAM基因的表達，以中劑量組（25 mg/kg）效果最明顯，說明人參皂苷Rg1可激活NRF-1在線粒體轉錄因子A（TFAM）啟動子上的轉錄功能，而TFAM是線粒體生物合成的直接調控因子，因此證明人參皂苷Rg1可改善線粒體功能和修復肌細胞的損傷，對骨骼肌肌細胞產生保護作用。

人參皂苷Rg1對疲勞模型小鼠的疲勞相關指標肝/肌糖原以及骨骼肌中抗氧化指標有很好的調節作用，并能有效調節骨骼肌中線粒體合成過程中的重要因子的表達水平，從而起到抗疲勞的作用。