歸芪多糖延緩大鼠腦組織衰老的作用機(jī)制

張凱麗，陳 博，田昌義，張 琦，張九洲，雷李濤，蒲秀瑛

（蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

腦老化是人類機(jī)體老化的突出表現(xiàn)之一[1]，腦組織衰老會(huì)發(fā)生一系列特征性改變，包括神經(jīng)細(xì)胞萎縮，腦細(xì)胞數(shù)減少，脂褐素沉積增多，細(xì)胞間突觸數(shù)量減少等[2]；腦衰老與腦梗死、阿爾茲海默癥帕金森病等疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系。因此，了解腦衰老的機(jī)制及如何延緩腦衰老對(duì)預(yù)防一些疾病具有重要意義。本研究所用歸芪多糖是通過(guò)水提醇沉的方法從經(jīng)典驗(yàn)方“當(dāng)歸補(bǔ)血湯”而來(lái)，其主要原料當(dāng)歸與黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源中藥，有悠久的藥用歷史。研究表明，歸芪多糖可增強(qiáng)抗氧化活性和免疫功能[3]，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)降低P53和P16蛋白質(zhì)的表達(dá)[4]，增加CyclinD1和SIRT1蛋白質(zhì)的表達(dá)[5]來(lái)延緩細(xì)胞的衰老。因此，作者以D-半乳糖誘導(dǎo)建立大鼠衰老模型，研究歸芪多糖延緩大鼠腦組織衰老的機(jī)制，為歸芪多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，使其在食品工業(yè)中具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

健康SD大鼠60只：購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，許可證編號(hào)：SYXK（甘）2019-0001，體質(zhì)量約180 g，雌雄各半，在SPF級(jí)別環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)操作遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定；GQP：作者所在實(shí)驗(yàn)室從當(dāng)歸（Angelica sinensis）和黃芪（Astragalus membranaceus）中提取（當(dāng)歸∶黃芪質(zhì)量比為1∶5）；D-gal、白藜蘆醇：購(gòu)自阿拉丁試劑公司；總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒、ATP測(cè)定試劑盒：南京建成生物公司研究所提供；BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、羅丹明123：購(gòu)自碧云天生物試劑；兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒：購(gòu)自中杉金橋。

1.2 儀器

臺(tái)式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏設(shè)備公司制造；包埋機(jī)：浙江省金華市科迪儀器制造；切片機(jī)：LEICA2016，德國(guó)制造；恒溫水浴鍋：HH-S4，北京科偉永興儀器有限公司制造；酶標(biāo)儀：INFINITE M PLEX，Tecan公司制造；流式細(xì)胞儀：AccuriTM C6 Plus，BD公司制造；超低溫離心機(jī)：TGL16E，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司制造。

1.3 動(dòng)物分組及造模

60只大鼠隨機(jī)分為6組，對(duì)照組（Control組）、模型組（Model組）、歸芪多糖低劑量組（LP組）、歸芪多糖中劑量組（MP組）、歸芪多糖高劑量組（HP組）、白藜蘆醇組（Res組）。除對(duì)照組外，其他組大鼠每日頸背部皮下注射D-半乳糖（150 mg/kg）（無(wú)菌條件下，用生理鹽水配制成150 mg/mL的D-半乳糖），同時(shí)LP組、MP組、HP組和Res組每天分別灌胃給予歸芪多糖0.5、1、2 g/kg（用蒸餾水配制50、100、200 mg/mL的溶液）和白藜蘆醇100 mg/kg（配制成10 mg/mL的溶液）；對(duì)照組給予等量的生理鹽水，連續(xù)給藥6周。

1.4 行為學(xué)觀察

造模期間觀察并記錄各組大鼠的體征及行為變化。

1.5 腦組織病理變化觀察

治療結(jié)束后，解剖大鼠，取大鼠腦組織，用預(yù)冷的生理鹽水清洗干凈，切取一半用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定，脫水、浸蠟、包埋、切片并進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織病理學(xué)形態(tài)變化。

1.6 腦組織中T-SOD、MDA、GSH、ATP的測(cè)定

稱取腦組織0.2 g，制成10%的組織勻漿，按照T-SOD、MDA、GSH、ATP測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定腦組織中T-SOD、MDA、GSH、ATP水平。

1.7 腦組織線粒體膜電位測(cè)定

線粒體制備：稱取漂洗干凈的腦組織0.2 g于玻璃勻漿器中，加入9倍體積預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.86%的生理鹽水，將勻漿器放置在盛有冰水混合物的器皿中充分研磨（6~8 min），使組織勻漿化，2 000 r/min離心10 min，棄沉淀，4℃條件下上清液以9 500 r/min離心15 min，沉淀即為線粒體。用BCA法測(cè)定線粒體蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。線粒體用PBS洗滌兩次，3 000 r/min離心10 min，加入10 mg/L羅丹明123 0.5 mL，37℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組線粒體膜電位變化（E x＝488 nm；E m＝530 nm）。

1.8 腦組織線粒體膜腫脹度測(cè)定

按照1.7中的方法提取腦組織線粒體，配制反應(yīng)緩沖液（蔗糖250 mmol/L，磷酸二氫鉀5 mmol/L，琥珀酸鈉3 mmol/L，氯化鈣0.3 mmol/L，pH7.2），調(diào)整線粒體蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，于520 nm處測(cè)定OD值，記錄0、2、4、6、8、10、20 min時(shí)的A520nm值，以吸光度的下降值表征線粒體的腫脹程度。

1.8 免疫組化分析Bcl-2、Bax的表達(dá)

厚度為10μm石蠟切片，脫蠟，水化，用體積分?jǐn)?shù)3%的過(guò)氧化氫封閉，孵育兔源的抗Bax和Bcl-2的抗體（1∶100），滴加羊抗兔IgG，DAB顯色，顯微鏡下觀察，顯示為棕黃色時(shí)終止反應(yīng)，酒精梯度脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行方差分析，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 行為學(xué)變化

對(duì)照中大鼠行動(dòng)敏捷，毛色光亮，精神狀態(tài)良好，模型組大鼠，行動(dòng)變遲緩，背部毛發(fā)變黃，變粗，掉毛，嗜睡，精神狀態(tài)較差。各GQP組和Res組大鼠較模型組活動(dòng)多，毛發(fā)脫落較少，精神狀態(tài)佳。

2.2 腦組織病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果見圖1。對(duì)照組大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元細(xì)胞排列較整齊，密集；模型組大鼠海馬區(qū)輪廓模糊，神經(jīng)元細(xì)胞密度降低，排列稀疏，細(xì)胞間質(zhì)變大；GQP組和Res組大鼠上述病理變化均有一定程度的改善。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色Fig.1 HE staining of rat brain tissues in each group

2.3 腦組織中T-SOD、MDA、GSH、ATP水平

各組大鼠腦組織中T-SOD、MDA、GSH、ATP比較結(jié)果顯示，模型組中T-SOD、GSH、ATP水平較正常組有所降低，MDA質(zhì)量摩爾濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相比，各GQP組和RES組中T-SOD、GSH、ATP水平升高，MDA質(zhì)量摩爾濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果見圖2。

圖2 GQP影響衰老大鼠腦組織中的SOD、MDA、GSH活性以及ATP水平Fig.2 Activities of SOD,MDA,GSH and ATP levels in the brain tissue of aging rats affected by GQP

2.4 腦組織線粒體膜電位變化

線粒體膜電位測(cè)定結(jié)果見圖3~4。對(duì)照組中熒光強(qiáng)度較弱，線粒體膜電位較高，模型組中熒光顯著增強(qiáng)（Rhl123+增加），線粒體膜電位去極化程度增強(qiáng)，線粒體膜電位降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而各GQP組和Res組，熒光強(qiáng)度降低，線粒體膜電位顯著升高（P<0.05）。

圖3 線粒體膜電位測(cè)定結(jié)果Fig.3 Mitochondrial membrane potential measurement results

2.5 腦組織線粒體膜腫脹度變化

對(duì)照組中A520nm降低較慢，模型組中吸光度下降快。與對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織線粒體膜的腫脹度顯著增加（P<0.01）；與模型組相比，GQP組和Res組線粒體膜的腫脹度降低（P<0.01），見圖5。

圖5 線粒體腫脹度Fig.5 Mitochondrial swelling

2.6 Bcl-2和Bax的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，Bcl-2和Bax蛋白質(zhì)陽(yáng)性信號(hào)顯示為棕黃色，對(duì)照組中可見大量的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞，模型組中有少量的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞，Bcl-2的表達(dá)顯著降低（P<0.01）；而GQP組和Res組中Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞較模型組中多，Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)增加（P<0.05）。對(duì)照組中Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，模型組中Bax陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，Bax的表達(dá)顯著增加（P<0.01）；但是，GQP組和Res組中可見少量的Bax陽(yáng)性細(xì)胞，Bax蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著降低（P<0.05），見圖6~7。

圖6 Bcl-2免疫組化圖和Bax免疫組化圖Fig.6 Immunohistochemistry of Bcl-2 and Bax

3 結(jié) 語(yǔ)

衰老是引起許多非傳染性急病、慢性疾病的因素之一，主要包括充血性心力衰竭、老年癡呆、心腦血管疾病、糖尿病和癌癥等。如何延緩衰老、提高人類健康是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一，也是整個(gè)生命科學(xué)研究面臨的挑戰(zhàn)。研究報(bào)道，內(nèi)源性抗氧化酶SOD、MDA、GSH等是組織氧化應(yīng)激的指示劑，決定了機(jī)體抗氧化損傷的能力[6]。SOD是機(jī)體內(nèi)存在的超氧自由基清除因子，能夠減輕氧自由基對(duì)機(jī)體的損害，從而延緩衰老[7]；MDA是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的主要降解產(chǎn)物，可以反映機(jī)體過(guò)氧化的程度；GSH具有清除自由基、抗氧化、抗衰老等生物功能。本研究結(jié)果顯示，GQP提高了大鼠腦組織中SOD和GSH水平，降低了MDA的質(zhì)量摩爾濃度，表明GQP可能通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化能力來(lái)降低自由基對(duì)機(jī)體的損害，從而發(fā)揮其延緩衰老的作用。

圖4 線粒體膜電位Fig.4 Mitochondrial membrane potential

ATP又稱為三磷酸腺苷，作為細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的“能量通貨”，用來(lái)儲(chǔ)存和傳遞化學(xué)能，為細(xì)胞各項(xiàng)生命活動(dòng)的供應(yīng)能量。因此ATP的含量可用于衡量細(xì)胞代謝相關(guān)的生命活動(dòng)，是衡量細(xì)胞衰老的最重要指標(biāo)之一[8]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供了能量，細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量95%來(lái)自線粒體，所以稱之為“細(xì)胞動(dòng)力工廠”。有研究表明，衰老細(xì)胞中的形態(tài)與功能發(fā)生明顯的變化，主要表現(xiàn)為線粒體膜腫脹程度增加，跨膜電位降低[9-10]。據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇可通過(guò)保護(hù)線粒體功能來(lái)延緩MSC的衰老[11]。線粒體膜電位的降低可以使線粒體能量產(chǎn)生障礙，能量代謝障礙是內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制之一[12]。本研究結(jié)果顯示，GQP升高了大鼠腦組織中ATP質(zhì)量摩爾濃度，同時(shí)GQP提高了腦組織線粒體膜電位變化，降低了線粒體膜腫脹程度。羅阿苗[5]等的研究也表明，GQP通過(guò)改善線粒體結(jié)構(gòu)功能從而延緩細(xì)胞衰老，與本研究結(jié)果一致。

圖7 Bcl-2和Bax的表達(dá)結(jié)果Fig.7 Expression results of Bcl-2 and Bax

Bcl-2家族中有的可以抑制凋亡（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等），有的可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡（Bax、Bak、Noxa等）。B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因是公認(rèn)的長(zhǎng)壽基因之一，大多位于線粒體外膜上，具有明顯抑制細(xì)胞凋亡的作用。當(dāng)Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞的存活期則延長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡。Bax基因是最主要的凋亡基因之一，編碼的Bax蛋白質(zhì)可與Bcl-2形成異二聚體，對(duì)Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用。研究表明，P53的過(guò)表達(dá)可以激活下游靶蛋白Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13-14]。過(guò)度表達(dá)的Bcl-2能抑制線粒體通透性改變，并影響巨孔的形成，從而抑制凋亡。本研究的結(jié)果表明，GQP增加腦組織中Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)，減少Bax蛋白質(zhì)的表達(dá)。上調(diào)Bcl-2/Bax比值，可使線粒體膜電位降低，減弱了線粒體膜的腫脹，從而改善細(xì)胞衰老，這與林文弢等[15]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，GQP可能通過(guò)減輕腦組織的氧化損傷來(lái)改變其線粒體的功能，調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而發(fā)揮延緩衰老的作用，此研究結(jié)果為GQP的進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。