兩階段轉速調控對納豆芽胞桿菌合成維生素K2的影響

馮靜靜，吳 靜，李 偉，周夢潔，胡汶松，汪 劍，薛正蓮，2，王 洲，2，劉 艷*，2

（1.安徽工程大學 生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000；2.微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖 241000）

維生素K2（VK2，MK-n）是一種重要的脂溶性維生素，在血液凝固和預防骨質疏松癥中發揮重要作用，并具有降低與心血管相關疾病的風險，以及抗腫瘤、改善Ⅱ型糖尿病患者的骨質、改善早期膝骨關節炎、保護腎功能等作用[1-3]。據統計，由于人口老齡化、久坐不動和維生素D缺乏癥日益嚴峻，導致2010年全世界約900萬例骨折，因此研究預防骨質疏松的高效率產品迫在眉睫[4]。而維生素K2作為預防骨質疏松癥的有效藥物，其價格昂貴、產量低、供不應求。維生素K2也被稱為甲萘醌（menaquinoe），它的萘醌環與4~13個異戊二烯單元組成的可變側鏈相連，生成一系列被稱為MK-n的異構體，其中n代表異戊二烯單元的個數[5]。

甲萘醌是呼吸鏈中重要的電子傳遞載體，因此很多微生物都可以產生甲萘醌。不同的菌株可以產生不同類型的甲萘醌[6]，納豆芽胞桿菌（Bacillus subtilis natto，Bsn）能夠產生MK-4~MK-8的MK同系物，MK-7占比可達96%，而黃桿菌主要產生MK-4和MK-6，一些腸道微生物如乳球菌、腸球菌也可以產生MKs[7-9]。納豆芽胞桿菌具有食用安全的特點以及發酵產生的MK-7含量高，被認為是微生物生產MK-7最主要和最有發展潛力的菌株[10]。近年來維生素K2（MK-7）的制備和產業化已成為研究的熱點。目前，獲取維生素K2的方法主要有微生物發酵法和化學合成法[11]，化學合成法通常具有產生低活性的順式異構體、副產物以及造成環境污染等弊端，而微生物發酵法所得產品的生物活性較高，因此廣受青睞。

發酵動力學具體研究發酵過程中各個參數之間的關系，包括細胞生長、基質消耗、產物生成速率之間的變化規律以及環境因素對三者的影響[12-13]，三者相輔相成，形成錯綜復雜的體系。張敏[14]等人將發酵動力學模型應用于糞腸乳酸球菌產γ-氨基丁酸（GABA），使GABA產量提高了60.1%。圣亞春[15]等人基于發酵動力學的分析，使丁醇產量提升了210.3%。通過發酵動力學分析，能夠深入研究微生物的新陳代謝規律，為后續產業化的過程控制以及工藝的優化提供理論支撐。

生物膜（biofilm，BF）是具有高度組織性的微生態系統，是細菌由浮游的單細胞狀態轉變為靜止的多細胞狀態的過程，隨后的生長導致了有組織的群落以及細胞分化[16]。它能夠附著在非生物介質的表面以及氣液相交的界面上，分泌的細胞外聚合物（extracellular poly-mericsubatances，EPS）主要包括胞外多糖、胞外蛋白、胞外DNA（extracellular DNA，eDNA），以此來增強對外界不利環境的抗性以及耐受能力[17-18]。有研究提到枯草芽孢桿菌生物膜的形成有利于維生素K2的產生[19]。靜置發酵能夠產生大量疏水性的生物膜，作者通過分析不同條件下（0、200 r/min）發酵進程曲線與發酵動力學參數，以及對不同時間點的發酵液進行稀釋涂布和掃描電鏡觀察菌體形態變化，明確菌體生長與產物合成之間的關系，根據結果提出分階段轉速調控的方法，并對其發酵條件（溫度、轉速、初始pH和時間）進行正交優化，進一步提高納豆芽胞桿菌合成維生素K2的產量，同時也為大規模生產維生素K2提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種

納豆芽胞桿菌GMCC2108 （Bacillus subtilis natto）：由作者所在實驗室保藏。

1.2 試劑

正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇（均為色譜純）、冰醋酸、結晶紫、乙醇、戊二醛（均為分析純）：購于上海生工。

萃取液為V正己烷∶V異丙醇=2∶1

流動相為V二氯甲烷∶V甲醇=1∶9

1.3 培養基

固體培養基（g/L）：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5，瓊脂20；pH 7.0，121℃滅菌20 min。

種子培養基（g/L）：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5；pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發酵培養基（g/L）：大豆蛋白胨50，酵母粉20，甘油50，K2HPO43.86，KH2PO41.62；121℃滅菌20 min。

1.4 培養方法

將在LB固體培養基上活化的納豆芽胞桿菌接種于種子培養基中，37℃、200 r/min培養至對數生長期，以體積分數2%將種子液接入50 mL/250 mL的搖瓶中，37℃于0 r/min與200 r/min分別發酵。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量的測定按照1.4的培養方法，發酵至相應時間，將菌液全部吸出離心，去除培養基，用PBS（7.4）緩沖液洗滌2~3遍，以完全去除培養基，離心稱濕質量，即為生物量（g/L）。

1.5.2 不同轉速條件下發酵前期菌落數比較在不同轉速條件下培養至所需要的時間，將發酵液稀釋至適當的濃度涂布，在相同濃度下比較菌落數量。

1.5.3 維生素K2產量的測定維生素K2標準曲線以及樣品的測定參照文獻[19]。

1.5.4 甘油殘余量的測定甘油標準曲線的繪制以及樣品的測定參照文獻[20]。

1.5.5 掃描電子顯微鏡樣品的制備樣品制備參照文獻[21]。

1.6 不同轉速下發酵動力學模型的建立

1.6.1 菌體生長模型Logistic方程是典型的S形曲線，可以很好地反應菌體濃度的增加對自身生長產生的抑制作用，且達到穩定期后菌體不再生長，納豆芽胞桿菌的生長過程可以用Logistic方程來描述，公式（1）。

式中：X為生物量，g/L；Xm為最大生物量，g/L；μm為最大比生長速率，h-1；t為發酵時間，h。

1.6.2 產物生成模型根據判斷細胞生長與產物生成在時間上的關系，可將其分為3類。當α≠0，β=0時為Ⅰ類發酵，即偶聯型發酵；當α≠0，β≠0時，為Ⅱ類發酵，即部分偶聯型發酵；當α=0，β≠0時，為Ⅲ類發酵，即非偶聯型發酵[14]，見公式（2）。

式中：P為維生素K2產量，g/L。

1.6.3 底物消耗模型維生素K2發酵過程中，甘油的消耗主要用于3個方面[22]，即甘油分解后產生的3-磷酸-甘油醛可以與丙酮酸通過DXP途徑合成維生素K2的異戊二烯側鏈部分；供納豆芽胞桿菌生長；為維生素K2的合成提供前體，促進菌體合成維生素K2。甘油消耗模型見公式（3）。

式中：S為甘油質量濃度，g/L；Yx/s為納豆芽胞桿菌對甘油得率，g/g；Yp/s為發酵產物維生素K2對甘油得率，g/g；m為維持系數，g/（g·h）。

2 結果與分析

2.1 不同轉速下維生素K2發酵進程曲線及動力學參數分析

研究了不同轉速下（0、200 r/min）菌體生長與產物合成的關系，結果見圖1。圖中各點為3個平行實驗的平均值±標準差，當轉速為0時，菌體能夠形成很厚的疏水性生物膜（圖2），使生物量大大提高，在48 h時生物量達到最大，為（67.08±2.1）g/L。之后隨著生物膜的溶解，生物量隨之緩慢下降，發酵結束時生物量為（63.21±1.3）g/L，比轉速為200 r/min時要高很多。可能的原因是：菌體在形成生物膜之后產生的胞外聚合物對菌體具有保護和抵御外界不良環境的作用，而未形成生物膜的菌體只是一少部分，少量菌體自溶；維生素K2產量在108 h達到最大值，為（21.32±0.08）mg/L。此時，甘油消耗殆盡，無法繼續供給菌體生長所需的能量，甘油除了供微生物生長之外，還能夠為維生素K2的合成提供前體，促進菌體合成維生素K2；隨后維生素K2產量的下降主要體現在兩方面[23-24]：一是維生素K2受到光解作用；二是位于細胞膜上的維生素K2在納豆芽胞桿菌的電子傳遞系統中作為電子載體參與電子傳遞鏈。而pH的升高是由于蛋白質水解和隨之而來的氨化作用導致的[25]。

圖1 不同恒定轉速條件下納豆芽胞桿菌產維生素K2發酵進程曲線Fig.1 Times courses of VK2 production by Bacillus subtilis natto at various constant rotational speed

圖2 生物膜的疏水性Fig.2 Hydrophobicity of biofilms

當增加轉速（200 r/min）時，最大生物量為（27.2±0.2）g/L，此時甘油所剩無幾，菌體生長受到限制。發酵過程中pH總體趨勢降低，可能是由于氮源代謝，氨基酸中的—NH2被利用后導致pH下降，過低的pH影響溶液的化學性質和氧化還原電位，破壞細胞的結構，使菌株對基質的利用速率降低，從而影響產物的合成。發酵結束時維生素K2的產量為（3.68±0.09）mg/L，遠低于0 r/min時的產量。納豆芽胞桿菌發酵時會產生表面活性物質和酶類，可能對細胞結構產生影響，從而使維生素K2的合成受到影響。雖然0 r/min培養的生物膜生物量高于200 r/min培養的生物量，但是將其稀釋涂布，發現其菌落數量小于200 r/min下培養的菌落數量，見圖3。可能的原因是：搖動培養時，細菌能夠很快增殖產生大量菌體；靜置發酵時在氣液界面產生大量生物膜，其主要成分為胞外多糖、胞外蛋白質和eDNA，生物膜的產生使靜置發酵的生物量比搖動培養的生物量高；測定菌落數時用的是發酵液，而靜置發酵的菌體大部分被生物膜吸附粘連很難洗脫，因此，靜置發酵的菌落數沒有搖動培養的菌落數多。

圖3 不同轉速下培養至12、24、36、48、60、72 h的菌落數量Fig.3 Number of colonies between different rotating speeds at 12,24,36,48,60 and 72 h

綜上所述，適合菌體生長的轉速和維生素K2合成所需的最適轉速并不統一。據文獻[26]報道，低轉速可以使孢子的產生時間推遲，有利于維生素K2產量的提高，而增加轉速可以使氧氣的供應量升高，有助于菌體的生長。因此，恒定的轉速不能使菌體生長和產物合成同時達到最佳的效果，為使兩者同時達到最佳狀態，提出分階段轉速控制發酵合成維生素K2。

2.2 不同轉速下菌體形態的變化

如圖4所示，對不同條件下（0、200 r/min）的菌體形態利用掃描電鏡觀察發現，0 r/min、24 h時菌體形態正常，箭頭所指為胞外聚合物；48 h時菌體表面有輕微褶皺；96 h出現大面積褶皺至發酵結束。而在200 r/min條件下，0~48 h菌體形態正常；72 h菌體開始破裂至發酵結束，但沒有破裂的菌體表面潤滑平坦。菌體形態產生的差異可能是導致維生素K2產量產生差異的原因之一。

圖4 不同固定轉速下各時間點的菌體形態Fig.4 Morphology of bacteria at different time points at different constant rotational speed

2.3 不同轉速下發酵動力學模型的分析

2.3.1 發酵動力學公式的求解當t=0時，X=X0，P=P0，S=S0，求得的公式（4）、（5）、（6）分別為：

將兩種不同轉速培養條件下的發酵參數作為實驗數據，通過1stOpt軟件撰寫程序，對上述動力學方程采用通用全局優化算法（First Optimization），不需設置初始值，便能找出最優解，根據實驗所得數據求出模型最優參數估計值，結果見表1~2。

由表1~2可知，兩種轉速培養條件下的α和β值均不為0，說明菌體生長與產物合成之間為部分偶聯關系；參數估計值顯示靜態發酵時μm、YP/S、YX/S大于動態發酵時的值，說明靜態發酵有利于維生素K2的生物合成，雖然靜態發酵時Xm的值比動態發酵時的值要高很多，但是將兩種不同條件下的發酵液進行稀釋涂布發現靜態培養條件下的菌落數明顯少于動態培養的菌落數，可能的原因是靜態培養條件下產生的生物膜成分主要為胞外多糖、胞外蛋白以及少量的eDNA，使生物膜生物量升高，但菌體數量少于動態培養，證明維生素K2產量的提高并不是由于生物量的升高而增加，可能是由于產生生物膜之后的一系列生理活動引起的。

表1 0 r/min發酵動力學參數預估值Table 1 Parameter estimation of the shake flask（0 r/min）fermentation kinetics model

對于要想獲得更大的維生素K2產量，通過改變和優化培養條件，盡可能減小維持系數m，使得μ值變大以及更高的菌體生物量X，是提高維生素K2產量行之有效的方法，通過比較靜態與動態發酵的實驗值與預估值，從表3~4可以看出，細胞生長、產物合成和底物消耗的預估值與實驗值接近，說明此模型能較好地反映納豆芽胞桿菌在250 mL搖瓶中0、200 r/min發酵過程的動力學。

表3 0 r/min發酵實驗值與預估值比較Table 3 Experimental value of shake flask（0 r/min）fermentation compared with the predicted value

表2 200 r/min發酵動力學參數預估值Table 2 Parameter estimation of the shake flask（200 r/min）fermentation kinetics model

表4 200 r/min發酵實驗值與預估值比較Table 4 Experimental value of shake flask（200 r/min）fermentation compared with the predicted value

2.4 兩階段轉速控制策略發酵條件的優化

根據上述試驗數據結合不同轉速下發酵動力學模型的理論驗證，證明菌體生長與產物合成之間為部分偶聯關系。若在相同的接種體積分數下培養，在發酵前期，0 r/min的菌落數不及200 r/min的菌落數，且生物膜形成的時間長，因此將分階段轉速調控方法用于發酵培養，并對影響其發酵的條件（溫度、轉速、初始pH、時間）進行正交優化，每個因素4個水平，采用L16（45）正交實驗設計方法，每組3個重復。

由表6試驗結果的極差分析可知，4個因素影響納豆芽胞桿菌產維生素K2的次序為D（時間/h）、A（溫度/℃）、C（初始pH）、B（轉速r/min）。正交實驗的最優組合為溫度40℃、初始pH 6.5、0~36 h控制轉速220 r/min，36~132 h轉速為0 r/min，維生素K2的產量達到（35.60±0.13）mg/L，比優化前（0 r/min和200 r/min）分別提高了1.67倍和9.674倍。因此，該方案可行，兩階段轉速控制方法可以有效地提高納豆芽胞桿菌合成維生素K2的能力，為維生素K2的大規模生產提供理論依據。

表5 實驗因素水平表Table 5 Factor level table

表6 L16（45）正交實驗結果Table 6 Result of L16（45）orthogonal test

3 結語

分析不同轉速下發酵過程曲線與動力學參數，并用掃描電鏡觀察菌體的形態變化。掃描電鏡結果顯示，0 r/min發酵后期菌體表面形態出現明顯的褶皺，但菌體很少破裂；對于200 r/min培養的菌體，在72 h菌體出現破裂、自溶現象，但正常菌體表面光滑平整無異常。根據不同條件下菌體生長和產物生成的關系，利用發酵動力學模型證明兩者之間的關系為部分偶聯型，提出分階段轉速調控的方法進行發酵，并對影響其發酵的條件進行優化。結果表明：溫度40℃、初始pH 6.5、0~36 h控制轉速220 r/min、36~132 h轉速為0 r/min，維生素K2的產量達到（35.60±0.13）mg/L，比優化前（0 r/min和200 r/min）分別提高了1.67倍和9.674倍，這使納豆芽胞桿菌合成維生素K2的能力顯著提高，為進一步大量生產維生素K2提供了依據。