提取條件對(duì)蜂花粉粗多糖抗氧化能力的影響

渠宏雁，李學(xué)鵬，陳永泉*

（1．江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2．江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013）

人類(lèi)對(duì)蜂產(chǎn)品的利用歷史悠久，蜂王漿、蜂膠和蜂花粉等蜂產(chǎn)品不僅可以食用，還能用作肌肉減少癥、急性肺損傷、癌癥等多種疾病的輔助治療[1-5]。蜂花粉多糖是蜂花粉的主要成分之一，目前已發(fā)現(xiàn)多糖提取物具有抗腫瘤、抗感染、降血糖血脂、控制細(xì)胞分裂和分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生化氧化和凋亡等多種重要的生理作用[6-9]。

長(zhǎng)期以來(lái)，氧化對(duì)食品品質(zhì)的影響備受關(guān)注，但主要都集中在氧化對(duì)脂質(zhì)的影響，而蛋白質(zhì)氧化對(duì)食品品質(zhì)的影響長(zhǎng)期被忽略。蛋白質(zhì)氧化和脂類(lèi)氧化均是由自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引起的[10]。包括羥自由基（·OH）、超氧陰離子（·O2－）、烷過(guò)氧自由基（ROO·）、過(guò)氧化氫（H2O2）等的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是引起食品蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化的前體物質(zhì)或促進(jìn)因子[10-11]。同時(shí)，ROS誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的自由基也可導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化，形成羰基衍生物和共價(jià)交聯(lián)物，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降、羰基形成、巰基含量減少等變化，從而引起蛋白質(zhì)變性或降解并進(jìn)一步影響食品品質(zhì)[10]。

眾所周知，脂質(zhì)氧化引起了食品酸敗，并造成多不飽和脂肪酸和維生素?fù)p失，然而，肉及肉制品在貯藏過(guò)程中發(fā)生的軟化現(xiàn)象和其他質(zhì)構(gòu)變化卻是由蛋白質(zhì)氧化變性和肌原纖維蛋白水解造成的。作者主要研究提取溫度和沉淀所用乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)3種蜂花粉粗多糖提取率和對(duì)自由基清除效果的影響，并對(duì)優(yōu)化提取所得蜂花粉粗多糖對(duì)大黃魚(yú)蛋白質(zhì)氧化的影響進(jìn)行了研究，以期為蜂花粉多糖的提取應(yīng)用及食品抗氧化相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰蜂花粉、野菊蜂花粉和茶花蜂花粉：購(gòu)自慈蜂堂；冰鮮大黃魚(yú)：購(gòu)自大潤(rùn)發(fā)超市，并全程置于冰上，盡快到實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移至-80℃凍藏備用；無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚、鄰苯三酚、鄰二氮菲、過(guò)氧化氫、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、鹽酸、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：除鹽酸為優(yōu)級(jí)純外其余均為分析純，均購(gòu)自阿拉丁。

1.2 儀器與設(shè)備

FA-2004型電子分析天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：鄄城威瑞科教儀器有限公司；SCF-06A型脂肪提取器：上海新嘉電子有限公司；722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蜂花粉粗多糖提取的前處理蜂花粉粗多糖的提取參考張國(guó)鋒等[12]的方法并略有改進(jìn)。分別稱(chēng)取玫瑰花粉、野菊花粉和茶花花粉100.0 mg各3份，適當(dāng)研磨破碎，分別裝入帶不同標(biāo)記的圓底燒瓶中，并分別加入150 mL蒸餾水。

1.3.2 蜂花粉粗多糖的提取將脂肪提取器溫度分別調(diào)至50、60、70、80、90、100℃進(jìn)行浸提濃縮，隨后冷卻過(guò)濾即可得到不同溫度浸提的蜂花粉多糖粗提物溶液待用。

1.3.3 蜂花粉粗多糖的沉淀用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液按4∶1的體積對(duì)蜂花粉多糖粗提物溶液進(jìn)行沉淀，得到不同溫度下提取出的蜂花粉粗多糖沉淀。

1.3.4 蜂花粉粗多糖的定量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[13]，將各溫度下提取的蜂花粉粗多糖沉淀溶解，分別于50 mL容量瓶中定容，離心去除沉淀后備用。吸取2 mL樣品置于加塞試管中，向其中加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%苯酚溶液，再向其中加入5.0 mL濃硫酸，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min，于490 nm處測(cè)定吸光度值，并以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出相應(yīng)的蜂花粉粗多糖的提取量，見(jiàn)公式（1），多糖提取率見(jiàn)公式（2）。

式中：x為吸光度值；y為蜂花粉粗多糖質(zhì)量濃度，mg/mL。

式中：Er為粗多糖提取率，%；V為粗多糖沉淀定容后的溶液體積，mL；c為葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；W為稱(chēng)取的花粉質(zhì)量，mg。

1.3.5 蜂花粉粗多糖對(duì)超氧陰離子的抗氧化活性的測(cè)定據(jù)鄰苯三酚自氧化原理[14]，量取2.8 mL pH 8.2的Tris-HCl（50 mmol/L）置于試管中，向其中加入100μL蒸餾水得粗多糖溶液，室溫靜置10 min，加入預(yù)熱的鄰苯三酚（60 mmol/L）100μL，搖勻，于420 nm處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算出相應(yīng)的清除率，見(jiàn)公式（3）。

式中：CL為清除率，%；A0為空白對(duì)照的吸光度值；Ax為加入蜂花粉粗多糖的吸光度值；Ax0為不加入蜂花粉粗多糖的吸光度值。

1.3.6 蜂花粉粗多糖對(duì)羥自由基的抗氧化活性的測(cè)定據(jù)芬頓（Fenton）反應(yīng)原理[15]，量取0.75 mol/L鄰二氮菲1 mL于試管中，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）和1 mL蒸餾水，混勻。再向其中加入1 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，混勻。然后分別加入1 mL 10 mmol/L H2O2溶液、1 mL蒸餾水和1 mL粗多糖溶液，37℃水浴60 min后于536 nm處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算出相應(yīng)的清除率，見(jiàn)公式（4）。

式中：CL為清除率，%；A1為加入蜂花粉粗多糖提取液的吸光度值；A2為加入H2O2的吸光度值；A3為空白對(duì)照的吸光度值。

1.3.7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜂花粉粗多糖抗氧化活性的影響將蜂花粉粗多糖溶液分別用體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液進(jìn)行沉淀，其他步驟同上。

1.3.8 大黃魚(yú)肌肉丙烯醛處理及肌原纖維蛋白的制備取大黃魚(yú)背部近頭肌肉切塊，用無(wú)菌水洗凈、瀝干（冰上操作），浸泡于5 mmol/L丙烯醛溶液中，25℃避光恒溫水浴24 h，取出后用超純水反復(fù)沖洗，置于干燥潔凈的紗布上吸去多余水分并隨后提取肌原纖維蛋白。

肌原纖維蛋白（鹽溶性蛋白）分離提取參照Pazos等[16]的方法并略有改動(dòng)。將大黃魚(yú)肉塊組織粉碎后加入5倍體積的10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）緩沖液中，采用組織勻漿機(jī)13 000 r/min勻漿5 min，4 500 g離心20 min，倒掉上部清液，將沉淀加入5倍體積的10 mmol/L Tris-HCl（含0.6 mol/L NaCl和200 mmol/L PMSF（蛋白酶抑制劑），pH 7.2）13 000 r/min高速勻漿，5 000 g離心20 min，取上清液，采用Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.9 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜂花粉粗多糖抗氧化活性的影響取1 mL、5 mg/mL的蛋白質(zhì)樣液和1 mL、10 mmol/L的2，4-二硝基苯肼（DNPH）溶液（含2 mol/L HCl）置于離心管中，室溫條件下避光靜置1 h（每隔15 min振蕩一次），加入等體積20%TCA，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，用2 mL乙酸乙酯和乙醇（體積比1∶1）混合溶液洗滌沉淀后置于5 mL、6 mol/L鹽酸胍溶液中，37℃孵育15 min，10 000 g離心3 min，取上部清液測(cè)定370 nm處吸光度值。對(duì)照組不經(jīng)DNPH處理，其余操作相同，見(jiàn)公式（5）。

式中：car為蛋白質(zhì)羰基濃度，nmol/L；A為吸光度值；V1為鹽酸胍的體積，L；ε為吸光系數(shù)，22 000 L/（mol·cm）；b為光程，1 cm；V2為蛋白質(zhì)取樣的體積，mL；cp為取樣蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溫度對(duì)蜂花粉粗多糖抗氧化活性的影響

2.1.1 蜂花粉粗多糖的定量測(cè)定熱水提取法是提取植物多糖最常用的方法，具有簡(jiǎn)單、方便、可操作性強(qiáng)、成本低廉的特點(diǎn)[17-18]。而苯酚-硫酸法則是常用的多糖測(cè)定方法之一，與蒽酮-硫酸法相比，具有不易受色氨酸和蛋白質(zhì)影響的特點(diǎn)[12]。由圖1可知，茶花花粉粗多糖在50~60℃之間提取率顯著增加，并在80℃達(dá)峰值，隨后逐漸減少；野菊花粉粗多糖的提取率隨溫度升高而增大，并于100℃時(shí)達(dá)到最大；與前兩種花粉相比，玫瑰花粉粗多糖的提取率受溫度影響較小，在50~90℃曲線一直較平穩(wěn)，100℃時(shí)達(dá)最大。由于粗多糖是活性物質(zhì)，溫度過(guò)高易破壞其結(jié)構(gòu)，影響其生物活性，故實(shí)際情況下3種花粉的提取溫度均以80℃為宜。

圖1 溫度對(duì)蜂花粉粗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of pollen polysaccharides

2.1.2 蜂花粉粗多糖抗氧化活性的測(cè)定超氧陰離子和羥自由基不僅是生命活動(dòng)中具有代表性的自由基，也是食品中常見(jiàn)的ROS，因此作者通過(guò)測(cè)定蜂花粉粗多糖對(duì)這2種自由基的清除效果來(lái)表征蜂花粉粗多糖的抗氧化活性。由圖2~3可知，3種花粉粗多糖對(duì)超氧陰離子及羥自由基的抗氧化活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。在50~70℃3種粗多糖對(duì)超氧陰離子的抗氧化活性曲線均呈現(xiàn)上升狀態(tài)，并于70℃時(shí)達(dá)峰值，隨后呈緩慢下降趨勢(shì)；其中野菊花粉粗多糖對(duì)超氧陰離子的抗氧化活性最強(qiáng)。而3種蜂花粉粗多糖對(duì)羥自由基的抗氧化活性則與此略有不同，茶花花粉粗多糖和玫瑰花粉粗多糖對(duì)羥自由基的清除率也在70℃達(dá)峰值，但野菊花粉粗多糖則在80℃時(shí)達(dá)峰值。從圖3中還可以看出，70℃時(shí)提取的玫瑰花粉粗多糖對(duì)羥自由基的清除率最高。此外，3種蜂花粉粗多糖對(duì)超氧陰離子的清除效果都優(yōu)于其對(duì)羥自由基的清除效果。羥自由基是目前已知活性氧壽命短但活性最強(qiáng)的自由基，對(duì)于芬頓反應(yīng)，羥自由基是酸性條件下的主要反應(yīng)物種[19]。而超氧陰離子則是生物線粒體內(nèi)膜上分子氧首先接受一個(gè)電子被還原得到的，是誘導(dǎo)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的起點(diǎn)，并可參與生理和病理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控[20]。另外，雖然熱水提取法所得粗多糖為混合物，乙醇沉淀和定容后離心并不能去除全部雜質(zhì)，也無(wú)法排除單糖的干擾。參考張翠香等[21]的研究結(jié)果，熱水浸提法所得蜂花粉多糖純度可達(dá)85%以上，因此認(rèn)為該法所提蜂花粉粗多糖在清除自由基的實(shí)驗(yàn)中起主要作用的活性成分為多糖。另外，本研究主要目的是探索蜂花粉粗提物對(duì)食品抗氧化特別是魚(yú)肉蛋白質(zhì)氧化的影響，故無(wú)須進(jìn)一步提純。因此，研究蜂花粉粗多糖對(duì)超氧陰離子和羥自由基的清除作用可表征其抗氧化能力，有利于今后蜂花粉粗多糖的實(shí)際應(yīng)用。

圖2 不同溫度下提取的蜂花粉粗多糖對(duì)超氧陰離子的清除效果Fig.2 Pollen polysaccharides against superoxide anion free radicals

圖3 不同溫度下提取的蜂花粉粗多糖對(duì)羥自由基的清除效果Fig.3 Pollen polysaccharides against hydroxyl free radicals

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜂花粉粗多糖的影響

2.2.1 沉淀劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗多糖提取率的影響由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%~60%時(shí)，3種花粉粗多糖的提取率都未發(fā)生明顯變化；乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%~70%時(shí)，茶花花粉粗多糖和玫瑰花粉粗多糖的提取率顯著升高，而野菊花花粉粗多糖提取率的增幅與其相比則較小；乙醇體積分?jǐn)?shù)70%~100%時(shí)，茶花花粉粗多糖和野菊花花粉粗多糖增長(zhǎng)趨勢(shì)逐漸趨于平緩，而玫瑰花粉粗多糖則在乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%~100%時(shí)再次顯著增加。由此可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，3種花粉粗多糖的提取率均逐漸增多，即所使用乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，沉淀效果越顯著；但不同的花粉變化趨勢(shì)并不完全一致，這可能是由于蜂花粉多糖成分復(fù)雜，不同來(lái)源的蜂花粉粗多糖所含各類(lèi)活性物質(zhì)的比例存在差異導(dǎo)致的。王昀等[22]、王建波等[23]和王博等[24]分別測(cè)定了紅花花粉、菊花花粉和玉米花粉的單糖和多糖成分，不同的蜂花粉來(lái)源的多糖主要成分和摩爾比均不同。本試驗(yàn)中所選擇的3種蜂花粉多糖成分可能也存在此類(lèi)差異，亟待后續(xù)研究進(jìn)一步求證。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜂花粉粗多糖的提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentrations on extraction rate of bee pollen polysaccharide

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蜂花粉粗多糖抗氧化活性的影響由圖5~6可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，3種花粉粗多糖對(duì)超氧陰離子自由基及羥自由基的清除率均逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)清除率最大，但實(shí)際操作中通常選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%或95%以起到除去蜂花粉粗多糖中水溶性雜質(zhì)的作用。從整體可以看出，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最高的是茶花花粉粗多糖；3種花粉粗多糖對(duì)羥自由基的清除效果差別不顯著。眾所周知，乙醇極易揮發(fā)不易殘留，且低劑量的乙醇能被人體迅速代謝，因此，選擇乙醇作為沉淀劑安全無(wú)害。

圖5 蜂花粉粗多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果Fig.5 Inhibition effect of pollen polysaccharides against superoxide anion free radicals

圖6 蜂花粉粗多糖對(duì)羥自由基的清除效果Fig.6 Inhibition effect of pollen polysaccharides against hydroxyl free radicals

2.3 蜂花粗多糖對(duì)大黃魚(yú)蛋白質(zhì)氧化的影響

如前所述，提取溫度80℃左右、乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%～95%時(shí)，所得蜂花粉對(duì)體外模擬的單一種類(lèi)自由基均有明顯的清除效果，其中對(duì)超氧陰離子的清除效果為最佳。為驗(yàn)證蜂花粉粗多糖是否在復(fù)雜的食品體系內(nèi)仍有較好的抗氧化效果，作者以經(jīng)過(guò)丙烯醛處理的大黃魚(yú)肌肉為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定羰基和總巰基的質(zhì)量摩爾濃度來(lái)評(píng)估蜂花粉粗多糖對(duì)大黃魚(yú)蛋白質(zhì)氧化的影響。如圖7~8所示，經(jīng)脂質(zhì)過(guò)氧化物丙烯醛處理的大黃魚(yú)肌肉羰基值顯著升高，總巰基值則顯著降低，表明3種蜂花粉粗多糖均能抑制丙烯醛誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化，其中又以野菊花粉粗多糖的抗氧化效果最佳。羰基質(zhì)量摩爾濃度是蛋白質(zhì)氧化最重要的指標(biāo)，丙烯醛的不飽和雙鍵可與蛋白質(zhì)肽鏈中的親核基團(tuán)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，其羰基可與蛋白質(zhì)氨基反應(yīng)形成希夫堿，使得蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)[25]。半胱氨酸（Cys）是最易被氧化的氨基酸，羰基值的變化并不能表征半胱氨酸的氧化情況，其特異性巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)換則通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)氧化的早期步驟[26-27]。

圖7 蜂花粉粗多糖對(duì)經(jīng)丙烯醛處理的大黃魚(yú)蛋白質(zhì)羰基質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig.7 Effect of pollen polysaccharides on the carbonyl content of myofibrillar proteins of Pseudosciaena crocea treated with acrolein

圖8 蜂花粉粗多糖對(duì)經(jīng)丙烯醛處理的大黃魚(yú)蛋白質(zhì)總巰基質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig.8 Effect of pollen polysaccharides on the sulfhydryl group content of myofibrillar proteins of Pseudosciaena crocea treated with acrolein

3 結(jié) 語(yǔ)

較高的提取溫度以及乙醇體積分?jǐn)?shù)均有利于蜂花粉粗多糖的提取，但溫度過(guò)高（超過(guò)80℃）其抗氧化活性反而呈下降趨勢(shì)，而所用沉淀劑乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，不利于去除蜂花粉中的水溶性雜質(zhì)，因此，提取溫度為80℃，沉淀劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%～95%時(shí)，蜂花粉粗多糖的提取率和對(duì)自由基的清除率均達(dá)到最優(yōu)水平。不僅如此，該優(yōu)化條件提取所得蜂花粉粗多糖還能夠使得經(jīng)丙烯醛處理的大黃魚(yú)肌原纖維蛋白羰基值降低而總巰基值升高，表明蜂花粉粗多糖能有效抑制大黃魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)氧化。