LAMP在阪崎克羅諾桿菌檢測中的研究進展

王彥人，焦敬波，張鈞森，康 青，李 萍，杜欣軍*

（1.天津科技大學食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

阪崎克羅諾桿菌為克羅諾桿菌屬（Cronobacter）中最為典型的一類食源性致病菌種，易感染全年齡段人群[1]，致死率高達40%~80%[2]，見表1。其感染引發的主要疾病有新生兒腦膜炎、腦膿腫、血痢、敗血癥以及壞死性小腸結腸炎等[3-6]，同時感染阪崎克羅諾桿菌后的幸存嬰幼兒還可能伴隨有嚴重的神經系統后遺癥[7]。Urmenyi和Franklin[8]于1961年首次報告了兩例由阪崎克羅諾桿菌引起的腦膜炎病例，隨后全世界相繼出現了相關的病例報告。近年來，國內外由該菌引發的食品安全事件仍屢有發生[9]，如在2004年我國安徽阜陽發生的“大頭娃娃”事件中，87份劣質奶粉樣品中有11份樣品被檢出含有阪崎克羅諾桿菌[10]，這也是我國首次從嬰兒配方奶粉中分離到該菌株。該菌廣泛分布于各類環境，如嬰幼兒配方奶粉生產設施、醫療機構和家庭環境等[1]。目前還尚未確定克羅諾桿菌的宿主和傳播途徑，但有相關研究指出，克羅諾桿菌能夠在嬰幼兒配方奶粉等低水分含量的食品中長期存活[12]，因此對于克羅諾桿菌的快速檢測是預防相關食品安全事件發生的重要手段。

表1 克羅諾桿菌屬種型及其典型菌株Table 1 Species types and typical strain in genus Cronobacter

傳統的檢測方法如酶聯免疫、電鏡觀察、細胞培養等表現出較大的局限性，如耗時長、重復性差、分辨力低、易表現出假陽性結果等，使用更精準快捷的檢測方法是未來食品安全檢測的必然需求[13]。而傳統PCR和qPCR技術雖能夠在幾小時內對靶標核酸序列進行特異性擴增，但由于PCR過程需要變性、退火、延伸等3個特定溫度步驟的多次循環，故需要精密的控溫儀器，不利于實地快速檢測和基層實驗室操作的推廣應用。20世紀90年代以來，無須進行熱變性的等溫擴增技術開始發展，其中環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于具有快速穩定、特異性強以及不依賴復雜反應設備的特點，已經開始被廣泛應用到復雜環境病原微生物的檢測中。同時，LAMP技術由于擴增效率高，能夠獲得更多的擴增產物（擴增子），故其可與各類簡便易行的檢測方法結合。隨著LAMP技術的廣泛化，對于其擴增子的檢測方法也不再僅僅受限于傳統的電泳法或熒光PCR法。新型檢測方法不僅具有更佳的時效性和便攜性，更伴隨著可觀的應用前景，然而目前國內對于該方面的綜述文章較少有系統性的體現。作者以克羅諾桿菌這一常見食源性致病菌作為切入點，著重于對結合了不同檢測方法的LAMP技術的近年研究進行歸納總結，旨在為后續阪崎克羅諾桿菌的快速檢測提供一定的理論參考。

1 LAMP技術

2000年，日本榮研化學株式會社Notomi[14]等人報道了一種新型的用于核酸高效擴增的環介導等溫擴增技術。該項技術主要基于在起始步驟中產生雙莖環結構DNA，并以此作為模版材料展開后續的LAMP過程[15]。目前該技術已被許多國家尤其日本廣泛應用于各個領域中，同時，基于LAMP的試劑盒現已被廣泛作為體外診斷的工具。

1.1 技術原理

與傳統PCR不同，LAMP通過針對靶基因的6~8個不同位點設計了4~6條特異引物[16]，依賴于具有鏈置換能力的Bst DNA聚合酶，在65℃左右的恒溫條件下對靶基因進行擴增，在1 h內即可實現109~1010倍的核酸擴增。首先在引物設計方面，先確定靶標基因的6個特異性位點——F1、F2、F3、B1、B2、B3，以及2對特異性位點之間的區域位點（圖1），其中F1c、F2c等位點分別與F1、F2等區域互補。根據上述位點設計下列引物：由F2和F1c組成的上游內引物FIP、由B2和B1c組成的下游內引物BIP、由F3區和B3區分別組成的上游外引物FOP和下游外引物BOP以及輔助加快循環效率的促環引物（loop-F/R，LF/R）[16]。

圖1 靶基因特異性位點及LAMP體系引物組成Fig.1 Target gene-specific loci and primer composition of LAMP system

1.2 擴增過程

LAMP反應可分為莖環合成和循環擴增兩個階段。以上游引物為例，首先FIP與靶標基因F2c區結合，在鏈置換酶的作用下向3′方向啟動延伸的同時解開雙鏈。隨即FOP與F3c區結合，并在新一輪延伸過程中將FIP合成的鏈替換下來，被替換下來的合成鏈會通過F1區與F1c區連接而在上游端形成自雜交的環狀結構。同樣，BIP和BOP則會引發合成鏈下游端的自雜交環狀結構，最終獲得兩類上下游端均有著自雜交環狀結構的雙莖環狀DNA作為后續LAMP擴增的模板。

兩類雙莖環狀DNA具有多個擴增起始位點，如3′端的B1區、莖環上的F2c和B2區等。以FIP與處于莖環的F2c區為例：從FIP上的F2區向3′方向開始鏈置換合成延伸[17]，形成2條新的雙莖狀DNA。BIP進而與其結合，開啟新一輪擴增，且產物DNA長度增加1倍。LAMP擴增體系中的促環引物LF和LR則能夠分別與莖環結構結合啟動新一輪的鏈置換反應，進而加快反應速率。

LAMP技術能夠以每小時109擴增子的倍增速度對靶DNA進行快速有效地擴增[14]，研究表明，相比于大多數傳統PCR或實時PCR技術，LAMP技術的DNA產量要高近20倍[18]。在臨床和食品檢測應用中，雖然LAMP在復雜食品或飼料中通常表現出較高的穩定性[19-20]，但是也會在一定程度上受到檢測抑制劑的干擾[21-22]。此外，由于LAMP的擴增效率遠高于傳統PCR，因此其后續對于擴增子的檢測方法也具有多樣性和時效性[23]。

2 基于LAMP技術的不同平臺在克羅諾桿菌快速檢測中的應用

LAMP技術能夠快速有效地靶向擴增目的基因，從而獲得大量的核酸擴增產物。除傳統的瓊脂糖凝膠電泳法外，LAMP能與多種檢測方法結合，對擴增產物進行快速準確的檢測，如肉眼觀察法、實時熒光法、生物發光法、免疫法等，應用于克羅諾桿菌的檢測研究見表2。

2.1 肉眼觀察法

在早期研究中，肉眼觀察法由于最直觀、快速且對儀器設備需求低而被廣泛應用于LAMP技術中，也是目前阪崎克羅諾桿菌LAMP檢測的常用方法。由于LAMP反應的擴增效率遠高于傳統PCR反應，因此能夠通過直接觀察來判斷LAMP產物的生成[24]。根據是否需要額外加入顯色劑，將肉眼觀察法分為濁度觀察法和顯色觀察法。濁度觀察法不需要額外加入顯色劑，是基于LAMP反應體系中DNA聚合消耗ATP所產生的大量焦磷酸鹽與體系中的鎂離子反應，生成焦磷酸鎂的白色沉淀[25]。顯色法則需要額外加入顯色劑，如常見的SYBR Green熒光染料，染料能夠與體系中雙鏈DNA的擴增產物結合進而釋放出熒光信號，使得陽性反應體系能夠在紫外照射下被清楚地觀察到。熒光染料檢測的靈敏度通常明顯高于濁度法。胡等[26]利用阪崎克羅諾桿菌的16S～23S rRNA設計引物，對純培養物和人工污染嬰兒配方奶粉樣本進行LAMP擴增，通過肉眼觀察其反應體系中白色沉淀，檢出限分別為0.101 CFU/mL和1.01 CFU/g，相比于常規PCR檢測技術，該方法顯示出較高的靈敏度，為常規PCR檢測的1 000倍。此外，馬等[27]根據阪崎克羅諾桿菌的16S rRNA和ompA基因分別設計LAMP引物，對純培養物進行擴增，并通過顯色法對LAMP產物進行檢測，結果表明ompA引物對應的檢出限為3 CFU/mL，為16S rRNA引物檢出限的1/10。同時ompA引物的特異性達100%（9/9），而16S rRNA引物的特異性僅為78%（7/9）。因此較16S rRNA基因，根據ompA基因設計的LAMP引物得到的檢測效果可能會更佳。表2歸納了不同技術平臺基于LAMP技術在崎克羅諾桿菌檢測中的應用[28-30]。

表2 環介導擴增技術檢測阪崎克羅諾桿菌Table 2 Detection of Cronobacter sakazakii by loop-mediated amplification technique

2.2 實時熒光定量法

RT-LAMP與RT-PCR的原理相同，均是根據熒光染料與LAMP擴增產物結合所產生的熒光信號對擴增進程進行實時定量的檢測。陳等[31]根據阪崎克羅諾桿菌的16S rRNA基因序列設計引物，進行RT-LAMP，結果表明其特異性達100%，無假陽性影響，檢測限為47 CFU/mL，較常規PCR靈敏度提高了100倍。另外，石等[32]也對阪崎克羅諾桿菌純培養物進行RT-LAMP，在保證特異性的同時，其檢測限可達到了8×10-2CFU/mL，與同等條件下的常規PCR相比，靈敏度提高了1 250倍。

2.3 生物發光法

近年來，美國3M公司推出了一款快速檢測致病菌的便攜式分子檢測系統（3MTM Molecular Detection System）。該設備的工作機理主要是通過加入腺苷-5′-磷酸硫酸、ATP磷酸化酶以及熒光素酶來耦合LAMP反應產生的焦磷酸鹽進行生物發光來達到自動化檢測目的，能夠在75 min內輸出1~96份樣本的檢測報告，對大批次高通量樣本的檢測具有顯著優勢。謝等[33]利用3M-MDS分別對阪崎克羅諾桿菌的純培養物以及人工污染食品樣本進行了檢測，通過結果分析發現該系統對純培養物的平均檢測限為1.79×103CFU/mL，且對于非目標菌株的檢測結果均為陰性，3M-MDS法的檢驗結果與傳統的生化鑒定國標法（GB 4789.40-2016）高度一致，能夠滿足乳制品及常見食品樣本的快速檢測要求。同樣，Patrick等[34]于2019年對改進后的3M-MDS技術進行評估，通過3M-MDS和國標上較新發布的平板劃線檢測標準（ISO 22964：2017）對人為控制污染的36組含益生菌嬰兒配方奶粉進行檢測，結果顯示兩者的陽性檢出率（POD，probability of dection）也沒有顯著性差異（P＞0.05），說明3M-MDS方法在食品檢測應用上對傳統培養的標準方法具有一定的替代潛力。另外有研究表明，在食品檢測時等溫擴增檢測的靈敏度一般比傳統常規PCR高1～3個數量級[35]。Kim等[36]對人為污染過阪崎克羅諾桿菌的嬰兒配方奶粉分別用3M-MDS與RT-PCR進行檢測，通過對比結果發現，3M-MDS對阪崎克羅諾桿菌的檢測限為102～104CFU/mL，PCR中較為靈敏的RT-PCR則為102CFU/mL。雖然現有3M-MDS方法較于RT-PCR并未對阪崎克羅諾桿菌顯示出更高的檢測靈敏度，然而在其他食源性致病菌的相關研究中，發現3M-MDS法（99.46%）比RT-PCR（98.74%）有更高的準確率[37]。

2.4 免疫法

免疫法是一類利用抗原抗體免疫結合反應的高特異性、高靈敏性的檢測方法。由于LAMP技術的問世時間較短，文獻庫中對阪崎克羅諾桿菌以LAMP免疫法作為檢測方法的研究相當有限。

2.4.1 酶聯免疫吸附法酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是指將抗原抗體免疫反應和酶（或模擬酶）催化作用相結合的技術。Zhang等以Fe3O4磁性納米粒子作為模擬酶探針，利用雙抗夾心法對阪崎克羅諾桿菌的ompA基因進行檢測，特異性達100%，檢測限為2 CFU/mL，并且該方法對不同濃度模板的結果呈線性響應，適用于定量研究[38]。同時，該研究還通過單疊氮丙二鈉（PMA）排除死菌的干擾，反映出體系內阪崎克羅諾桿菌的存活狀態，對實際檢測具有較高的潛在應用價值。

2.4.2 電化學免疫傳感器法電化學免疫傳感器是將電化學分析與免疫學技術相結合的一類分析器件，通過傳感器件將分子識別標記物（抗原或抗體）免疫反應產生的化學信號轉化為電信號，用于對靶標物質的痕量分析研究[39]。Guo等[40]通過將LAMP核酸信號放大、三元催化發夾結構自組裝技術（catalytic hairpin assembly，CHA）以及血糖檢測儀進行耦合，對人工合成的阪崎克羅諾桿菌ompA基因進行檢測，最低檢測值可低至20擴增子（1.32×10-18mol/L），在便攜式檢測領域具有很大的應用潛力。

2.4.3 橫向流動試紙條法橫向流動試紙條（lateral flow dipstick，LFD）包含檢測線和質控線，其中兩者分別了錨定了特定熒光素的抗體，能夠與LAMP擴增子中的熒光素結合，實現顏色變化并進行檢測判別，較大程度上擺脫了對設備的依賴性。Fu等[41]基于22個阪崎克羅諾桿菌的全基因組序列比對出的保守核心基因序列（CSK29544_00235及CSK29544_03484基因）設計引物，結合LAMP-LFD的方法對22株克羅諾桿菌的純培養物進行檢測，靈敏度達100%，且對其他菌株無假陽性出現，檢測限為4.5 CFU/mL；而對人工污染克羅諾桿菌的牛奶樣品的檢測限則為57 CFU/g，比PCR-LFD檢測限均高出2個數量級。Yang等[42]基于核糖體ITS基因對人為污染阪崎克羅諾桿菌的嬰兒配方奶粉進行多重LAMP-LFD方法的檢測應用，該方法對于80類不同奶粉樣本特異性達100%，檢測限達到2.8 CFU/g。

綜上，LAMP能夠結合各種后續擴增子檢測方法且較好地應用于該致病菌最常見載體——乳制品奶粉中，比傳統PCR普遍表現出了更高的靈敏度。然而LAMP所需的引物設計要求較嚴苛，6條引物嚴格對應靶標基因相應位置，比PCR引物復雜程度更大；同時由于LAMP帶來的大量擴增子產物易在實驗室等封閉環境形成氣溶膠污染，進而對后續LAMP實驗帶來假陽性或靈敏度的干擾，這些存在的問題需要通過對操作人員的規范培訓及通過加入某些LAMP輔助劑進行克服改進。

3 展 望

阪崎克羅諾桿菌作為一類常見的食源性致病菌，會對嬰幼兒等免疫力低下的人群造成致命威脅，因此建立和改進針對阪崎克羅諾桿菌的快速檢測方法和技術極為必要。當今國際社會普遍以FDA推薦的傳統生理生化鑒定和PCR技術作為標準檢測手段，相較于以上方法，LAMP具有時效性好、特異性強、靈敏度高、無須煩瑣的溫度控制、對設備的依賴性低等優點，且擴增效率遠高于傳統PCR。LAMP同時可以與各種不同擴增子的檢測方法相結合，如具有高通量能力的3M-MDS法，便攜性的LFD法等。但是，LAMP也存在氣溶膠干擾嚴重、引物設計復雜、不能直接針對活菌檢測等不足，未來的研究主要是解決以上問題，降低實驗成本，實現現場實時檢測。現今隨著LAMP技術的不斷發展完善和快速檢測需求的提高，其必將在阪崎克羅諾桿菌的檢測領域占有重要位置，具有廣闊的應用前景。