秦建文，張楠，劉小林，陳蘇杭，周和平

(中國科學院國科醫(yī)療江油醫(yī)院泌尿外科，四川 江油 621701)

膀胱癌屬于泌尿系統(tǒng)高發(fā)惡性腫瘤，有調(diào)查[1]顯示，在成人惡性腫瘤中，膀胱癌約占8%左右。研究膀胱癌進展與復發(fā)機制，對指導臨床診治，降低患者復發(fā)率、改善預后具有重要意義。纖蛋白3(Fibulin-3)屬于細胞外基質(zhì)中的糖蛋白，在人體廣泛表達[2-3]。有研究[4]表明，細胞外基質(zhì)中Fibulin-3起著構(gòu)架作用，并可作用于下游信號通路，激活表皮生長因子受體信號通路。多種實體瘤患者腫瘤組織Fibulin-3異常表達，具有腫瘤促進作用[5]。SUMO特異性蛋白酶1(SENP1)可對腫瘤血管形成產(chǎn)生重要調(diào)控作用，參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展[6]。核受體輔激活因子1(NCOA1)為依賴配體的相應轉(zhuǎn)錄因子，在多種病理組織中呈現(xiàn)高表達水平，可能參與肥胖、癌癥以及糖尿病病理[7]。本文旨在探究膀胱癌患者癌組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達情況與疾病進展及復發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月至2017年3月中國科學院國科醫(yī)療江油醫(yī)院收治的104例膀胱癌患者的癌組織和癌旁組織為研究對象。納入標準：(1)具有手術(shù)適應癥，并接受根治性全膀胱切除術(shù)；(2)病理證實為膀胱癌；(3)臨床資料完整；(4)精神、意識正常，簽署研究知情同意書。排除標準：(1)合并嚴重心、肝、腎等疾??；(2)其他惡性腫瘤患者；(3)具有傳染病史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 包括性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、腫瘤直徑、TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及隨訪3年疾病復發(fā)情況。

1.2.2 免疫組化檢測 取自手術(shù)切除的癌組織與相應配對癌旁(與腫瘤間隔>5 cm)正常組織。石蠟包埋切片，利用檸檬酸鹽修復液進行抗原的修復；以3%過氧化氫連續(xù)孵育10 min，同時對內(nèi)源性過氧化物酶進行封閉處理；以山羊血清封閉。接著分別放入Fibulin-3單克隆抗體、SENP1單克隆抗體及NCOA1單克隆抗體，均由Abcam 公司提供，置于4 ℃條件下孵育過夜。第2天以山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(經(jīng)辣根過氧化物酶進行標記，控制稀釋比等于1∶50)處理，室溫下連續(xù)孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，并以蘇木素復染，利用二甲苯進行透明處理。注意以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，用于陰性對照。安排兩名病理科醫(yī)師，通過雙盲法獨立完成閱片過程。結(jié)果評估：在各切片之中隨機取五個觀察視野(400×)，進行染色評估，并在200個細胞之中，算出陽性細胞所占百分比。染色評分標準：顯示淡黃色為1分；顯示棕黃色為2分；顯示棕褐色為3分；陽性細胞百分比評分標準：百分比<10%為1分；10%<百分比≤50%為2分；50%<百分比≤80%為3分；百分比>80%為4分。染色評分+百分比評分>3分提示陽性表達[8]。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色 采用10%甲醛固定組織樣本，石蠟包埋之后進行HE染色。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析與處理。計數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗；相關(guān)性采用Logistic回歸模型分析；生存分析采取Kaplan-Meier生存曲線分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌與癌旁組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達比較

膀胱癌組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達陽性率高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 膀胱癌與癌旁組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達比較[n(%)]

2.2 不同臨床特征患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達陽性率比較

不同性別、年齡、BMI、腫瘤直徑患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同TNM分期、病理分級、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 Logistic單因素與多因素回歸分析

Logistic回歸分析顯示，F(xiàn)ibulin-3、SENP1、NCOA1表達情況與TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表2 不同臨床特征患者Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達陽性率比較[n(%)]

續(xù)表2

表3 Logistic單因素與多因素回歸分析

2.4 Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達與疾病復發(fā)的關(guān)系

隨訪發(fā)現(xiàn)，104例患者共復發(fā)46例(腎盂腫瘤6例、盆腔復發(fā)5例、尿道復發(fā)3例、遠處轉(zhuǎn)移32例，其中遠處轉(zhuǎn)移包括肺9例、骨10例、肝6例、腹膜后盆腔淋巴結(jié)7例)，中位隨訪時間29(28～31)個月。Fibulin-3、SENP1、NCOA1表達陽性患者3年無進展生存率低于表達陰性患者(χ2=12.793、35.840、12.558，P<0.05)。見表4、圖1-圖3。

表4 復發(fā)情況[n(%)]

3 討論

Fibulins與參與構(gòu)成人體細胞外基質(zhì)，當前已知包含七個基因型，F(xiàn)ibulin-3具有調(diào)控細胞生長與相關(guān)信號轉(zhuǎn)導作用，同時在腫瘤發(fā)生及演進中起著重要作用[9]。相關(guān)研究[10-11]表明，卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌以及胰腺癌中Fibulin-3具有過表達表現(xiàn)，且和腫瘤進展、患者不良預后有關(guān)，關(guān)于作用機制，可能由于Fibulin-3啟動子區(qū)處于超甲基化狀態(tài)，造成腫瘤惡化。亦有報道[12]認為，對于膀胱癌而言，F(xiàn)ibulin-3屬于前侵入因子。本研究中，相較于癌旁正常組織，膀胱癌組織Fibulin-3陽性率升高(P<0.05)且與腫瘤TNM分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤深度緊密相關(guān)(P<0.05)，與上述研究觀點相符。說明Fibulin-3可能參與膀胱癌的發(fā)生及進展，考慮可能與Fibulin-3調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、基質(zhì)金屬蛋白酶分泌、血管生成、相關(guān)信號通路(包括NOTCH、MAPK以及AKT等)有關(guān)[13]。有研究[14]表明，SENP1屬于缺氧誘導因子1α(HIF-1α)調(diào)控靶基因，SENP1與HIF-1α通過正反饋作用可增加肝癌干細胞特性，加快肝癌產(chǎn)生。以往研究以前列腺癌患者為對象，發(fā)現(xiàn)病灶組織里面SENP1呈現(xiàn)為高表達，其參與腫瘤侵襲以及復發(fā)；通過抑制SENP1表達，能夠影響 HIF-1α與相應信號通路中下游部位基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2) 與基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)骨重構(gòu)作用，從而起到抑制骨轉(zhuǎn)移效果[15]。本研究中，膀胱癌組織SENP1陽性率高于癌旁正常組織(P<0.05)；Logistic分析發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤浸潤深度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級有關(guān)(P<0.05)，表明SENP1可能具有促進膀胱癌進展作用，原因可能和其調(diào)控 HIF-1α活性及其下游血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有關(guān)。鑒于SENP1、Fibulin-3均能夠調(diào)控血管生成，故考慮兩者在膀胱癌進展中可能具有協(xié)同作用。HIF1α可能通過結(jié)合以及激活轉(zhuǎn)錄因子NCOA1的方式，調(diào)控C-X-C趨化因子受體4，從而加快腫瘤轉(zhuǎn)移[16]，推測SENP1與NCOA1共同參與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移。有報道[17]顯示，膀胱癌患者NCOA1蛋白表達水平和臨床分期、是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等存在顯著相關(guān)性。本研究顯示，膀胱癌組織NCOA1陽性率異常升高(P<0.05)，并和腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05)，與上述研究觀點一致，并創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)NCOA1和膀胱癌病理分級及浸潤等進展密切相關(guān)。NCOA1能夠通過提高雄激素受體(AR)活性的方式介導細胞增殖，對其進行敲除，可以減少雄激素依賴的相應細胞(如LNCap細胞)增殖，同時對AR依賴細胞(如C4-2細胞)生長產(chǎn)生抑制作用[18]。

以往關(guān)于不同F(xiàn)ibulin-3、SENP1、NCOA1表達膀胱癌患者生存分析的研究極少。本研究經(jīng)生存分析創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ibulin-3、SENP1、NCOA1表達陽性患者3年無進展生存率明顯更低(P<0.05)，提示Fibulin-3、SENP1、NCOA1陽性膀胱癌患者存在更高疾病進展與復發(fā)風險。

綜上，相較于正常組織，膀胱癌組織Fibulin-3、SENP1、NCOA1陽性率更高，且和疾病進展與復發(fā)緊密相關(guān)，其檢測對患者疾病診治及預后評估具有重要指導價值。但本研究具有一定局限性，比如樣本量較少，為單中心研究，且僅采用免疫組化分析法，方法有限，關(guān)于Fibulin-3、SENP1與NCOA1參與膀胱癌進展與復發(fā)具體分子機制，有待后續(xù)大樣本、多檢測方式及多中心研究進一步探究、補充與完善。